293 [HEK-293] 細胞是經(jīng)人腺病毒5(Ad5)轉染而形成的人胚腎細胞永生化細胞系，293細胞包含并表達轉染的Ad5基因。293T細胞是293 [HEK-293] 細胞株插入了SV40 T-antigen的溫度敏感基因形成的高轉衍生株，廣泛用于病毒包裝，呈上皮樣，貼壁，營養(yǎng)體系是DMEM+10% FBS。

表1 293T細胞基本信息

圖1 293T [HEK-293T] （人胚腎細胞）
 

一、首先我們討論的是為啥293T細胞傳代后聚團嚴重？如圖2所示，背景貼壁細胞貼壁良好，形態(tài)正常，而黃色團塊則是因為消化不當形成的細胞團，難以貼壁，并出現(xiàn)了成簇增殖。
 

圖2 293T [HEK-293T] （人胚腎細胞）
 

這種情況多半是胰酶消化操作不當導致的細胞聚團：

1）消化過度或吹打過猛導致細胞受傷嚴重，破損的細胞碎片容易粘連聚團；

2）消化時細胞融合率太高，成片脫落，將不容易被吹散，容易聚團。

解決細胞消化不當，要考慮細胞的生長特性，鑒于該細胞貼壁疏松，普通0.25%胰酶消化時間控制在15s-30s；吹打動作輕柔，控制在10-20次；細胞融合率達到80%傳代即可傳代。

二、接下來咱們要討論的是為啥293T換了血清批次后聚團嚴重？如圖3所示，換血清批次后嚴重聚團的293T細胞，細胞形態(tài)難以分辨，黏附在一起。
 

導致細胞聚團的因素很多，其一是血清批間差導致細胞聚團。

血清來源于動物，其組成成分有1000種左右，且血清組成及含量常隨供血動物的年齡、生理條件和營養(yǎng)條件而異。每個批號的組分百分比含量都是不固定的，所以批間差異是存在的。293T細胞本身有聚團生長特性，但嚴重聚團可能受到血清里的某些因子刺激。
 

圖3 換血清批次后嚴重聚團的293T細胞
 

如何有效地預防血清批間差呢？可以通過先用血清試用裝，試用效果好，可購買和血清試用裝批次相同的正裝，囤積半年或一年的用量，有效避免批間差對細胞的影響（胎牛血清在-20℃保存可達5年）。
 

三、接下來我們要討論的是293T細胞貼壁性問題。通常有兩種情況，

第一種情況是為啥用了新批號的血清，細胞貼壁性變差？如圖4所示，貼壁疏松的293T細胞。
 

圖4 貼壁疏松的293T細胞
 

這種情況大概率是血清存在批間差異，而293T細胞本身特點就是貼壁性差，對不同批次的血清適應性不同，就容易出現(xiàn)貼壁疏松現(xiàn)象�？蛇m當加高血清比例（最高不超過20%）；建議試好一個血清批次多屯一些，可以避免血清批間差對細胞的影響。

第二種情況是為啥293T細胞從瓶里（例如T25）鋪板到孔里（96孔板），貼壁性變差？這種情況排除掉瓶和孔板本身材質或TC（親水處理）處理因素外，293T細胞貼壁性變差極有可能是因為空間的隔離導致細胞自分泌或旁分泌產生的信號分子濃度太低，不利于細胞的貼壁或增殖。建議在鋪板前，對孔板進行明膠（abs9357）包被，可有效促進細胞貼壁。
 

四、最后咱們要討論的是轉染病毒后細胞凋亡嚴重，如圖5所示，是經(jīng)病毒轉染后漂浮凋亡的293T細胞。
 

圖5 經(jīng)病毒轉染后漂浮凋亡的293T細胞
 

為啥293T細胞轉染病毒后凋亡嚴重？在排查了方法步驟和轉染試劑，依然沒有改善的情況下，可排查一下轉染前的營養(yǎng)體系，尤其是血清批間差帶來的影響。很多同學說前期培養(yǎng)細胞形態(tài)正常呀，其實細胞形態(tài)學只是鑒別細胞是否健康的一個外在指標，還要結合細胞其它指標對細胞健康進行評定（比如倍增時間，存活率）。通過更換血清批次，再進行轉染實驗并觀察轉染后的效果，比較分析出原因。