內(nèi)毒素或脂多糖（LPS）是革蘭氏陰性菌外膜 （OM）外葉（OL）的組成部分。它是一種獨(dú)特的分子，被后生動(dòng)物免疫系統(tǒng)用作原核生物入侵的標(biāo)記，并作為多種革蘭氏陰性菌OM成分（包括磷脂和表面蛋白）中的單一成分出現(xiàn)。

LPS根據(jù)USP參考標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量要求從其他雜質(zhì)中純化出來(lái)。  高度純化的材料被用作標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素 （RSE/CSE），它在歷史上一直用于分析定義內(nèi)毒素。在工業(yè)上，有些人希望為各種目的制備一種非純化的或“天然的標(biāo)準(zhǔn)品”，并將這些制劑稱為“天然內(nèi)毒素”。本文概述了美國(guó)藥典（USP）¹規(guī)定的一些標(biāo)準(zhǔn)要求，并詳細(xì)闡述了內(nèi)毒素與其他細(xì)胞成分不同的定義。

一、標(biāo)準(zhǔn)化
USP 40一般要求<11>的摘錄指出：

“美國(guó)藥典公約（USP標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或RS）提供的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是反映特定藥物和食品（原料藥、生物制劑、賦形劑、膳食補(bǔ)充劑、食品成分、雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、試劑和性能驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)品）的高度表征本。當(dāng)批準(zhǔn)適合用作USP或國(guó)家處方集 （NF） 中文件測(cè)試或化驗(yàn)的比較標(biāo)準(zhǔn)（即，作為專著組成部分）時(shí)，USP RS也在美國(guó)獲得官方地位和法律認(rèn)可。

USP <11> 的“雜質(zhì)參考標(biāo)準(zhǔn)”部分指出：“雜質(zhì)參考標(biāo)準(zhǔn)可以作為純化的單一組分材料或作為多種雜質(zhì)的混合物出現(xiàn)。” 工業(yè)界要維持當(dāng)前的“內(nèi)毒素”標(biāo)準(zhǔn)（BET <85>），而不是“革蘭氏陰性細(xì)胞壁”標(biāo)準(zhǔn)，必須對(duì)其進(jìn)行純化和高度表征，否則它將成為“混合雜質(zhì)”標(biāo)準(zhǔn)，并被貼上這樣的標(biāo)簽。
 

圖1：分解成相關(guān)組成部分的內(nèi)毒素定義

1. LPS生物合成；
2. 宿主反應(yīng)的相互特異性；
3. 革蘭氏陰性菌外膜的不對(duì)稱性；
4. 對(duì)比成分。

圖2：LPS獨(dú)特的結(jié)構(gòu)定義³
 

圖3：革蘭氏陰性菌的LPS激活宿主先天免疫反應(yīng)。Ryu等人研究了LBP-CD14介導(dǎo)的LPS轉(zhuǎn)移到TLR4-MD-2至單分子分辨率的動(dòng)態(tài)中間體。⁵

斷言LPS本質(zhì)上是“未純化的”似乎是語(yǔ)義問(wèn)題；它在其生物合成中以單一分子開(kāi)始，在哺乳動(dòng)物受體中作為單一分子結(jié)束。出于哺乳動(dòng)物檢測(cè)的目的，它已通過(guò)當(dāng)前的分析方法盡可能地純化。請(qǐng)參閱圖3 中（規(guī)范的）哺乳動(dòng)物檢測(cè)級(jí)聯(lián)的概述。⁶

3. 革蘭氏陰性菌外膜的不對(duì)稱性
從能量上講，革蘭氏陰性菌的作用是維持與革蘭氏陰性菌外膜相關(guān)的不對(duì)稱性。這保持了一個(gè)有效的屏障，防止疏水性“斑塊”的形成，疏水“斑塊”可能允許不需要的物質(zhì)（即抗生素）不加選擇地通過(guò)。這是治療革蘭氏陰性菌感染困難的原因之一。如果我們看一下常見(jiàn)的革蘭氏陰性菌表面的常見(jiàn)教科書(shū)圖，就會(huì)清楚地看到“不對(duì)稱”發(fā)生的位置（圖4）。⁶
 

圖4：革蘭氏陰性和陽(yáng)性細(xì)菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)⁶

由于革蘭氏陰性菌外膜外葉由LPS組成，而內(nèi)葉由磷脂 （PL） 組成，因此會(huì)發(fā)生不對(duì)稱性。⁷如果外葉中聚集了足夠的磷脂，則細(xì)胞有專門(mén)的方法來(lái)重建不對(duì)稱性；包括“漂浮”在新的LPS分子中。⁸內(nèi)毒素作為單一分子實(shí)體的長(zhǎng)期定義包括其形成這種不對(duì)稱屏障的獨(dú)特能力。因此，磷脂和LPS作為單獨(dú)的革蘭氏陰性菌外膜（圖3）的比例是一個(gè)重要的屬性。  

4.對(duì)比成分
有時(shí)，通過(guò)描述它不是什么而不是它是什么來(lái)定義某物更容易。內(nèi)毒素不包括其他膜相關(guān)分子。它是六種無(wú)法通過(guò)其他方式檢測(cè)到的細(xì)菌殘留物的質(zhì)量或分析標(biāo)志物，因此是制藥生產(chǎn)中的關(guān)鍵質(zhì)量屬性。一種與LPS共享革蘭氏陰性表面的革蘭氏陰性菌外膜成分類型是“孔蛋白”�？椎鞍资堑鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)，通常以三聚體形式存在，可調(diào)節(jié)水、溶質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞的通道。 
 

圖5：反硝化菌胞外表面的高分辨率分析。
A） 膜區(qū)域密集排列著孔蛋白三聚體。
B） 在高分辨率下，子結(jié)構(gòu)在單個(gè)三聚體上可見(jiàn)。⁹
 

革蘭氏陰性菌外膜的概念最近發(fā)生了變化，因?yàn)閷?duì)活細(xì)菌的原子力顯微鏡（AFM） 研究發(fā)現(xiàn)了主導(dǎo)革蘭氏陰性菌表面的孔（圖5）。⁹這些編織的蛋白質(zhì)鏈形成空心的“管”，從表面向下延伸穿過(guò)外膜并進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)（圖6D和E）。LPS通過(guò)基于鱟的測(cè)試提醒制造商注意革蘭氏陰性菌的存在；然而，孔蛋白目前還無(wú)法被檢測(cè)到。 
 

圖6：革蘭氏陰性菌外膜⁹中孔蛋白的天然超分子組裝的原子模型

使用原子力顯微鏡（AFM），Oestreicher等人。¹⁰研究了來(lái)自大腸桿菌和類球紅細(xì)菌的兩種典型革蘭氏陰性細(xì)菌結(jié)構(gòu)，并指出：“我們的研究清楚地表明，這兩種類型的細(xì)胞都有一個(gè)外表面，該外表面覆蓋著類似于分枝桿菌的納米大小的孔網(wǎng)絡(luò)。” 與LPS一樣，孔蛋白是獨(dú)立的持久結(jié)構(gòu)，具有免疫反應(yīng)性且難以破壞。“孔蛋白是極其堅(jiān)固的蛋白質(zhì)，可以在70°C的5M鹽酸胍或2%SDS存在的情況下可以抵抗變性。” ¹¹鑒于孔蛋白本質(zhì)上具有免疫原性，因此應(yīng)該引起人們的興趣。^12,13

雖然它不會(huì)改變LPS作為強(qiáng)效污染物的作用，但它清楚地表明LPS并不代表整個(gè)革蘭氏陰性菌表面，其革蘭氏陰性菌外膜而是由幾種離散物質(zhì)組成。

三、總結(jié)
內(nèi)毒素的詳細(xì)定義支持純化LPS作為標(biāo)準(zhǔn)化雜質(zhì)（RSE/CSE）的歷史和持續(xù)使用：

（a）內(nèi)毒素是一種具有特殊組裝的獨(dú)特結(jié)構(gòu)（九個(gè)酶促步驟）；

（b）后生動(dòng)物對(duì)LPS的反應(yīng)（通過(guò)TLR4）的特異性與其他反應(yīng)（例如激活TLR2 的孔蛋白或激活TLR5的鞭毛）是分開(kāi)的；

（c）它包括內(nèi)毒素在產(chǎn)生和維持革蘭氏陰性菌外膜與磷脂成比例的不對(duì)稱性方面的作用

（d）它作為與其他外膜結(jié)構(gòu)分開(kāi)和相鄰的單一結(jié)構(gòu)存在，在結(jié)構(gòu)、功能和免疫反應(yīng)（TLR激活）方面提供了對(duì)比。

應(yīng)努力開(kāi)發(fā)新的測(cè)試方法來(lái)檢測(cè)重要的非LPS膜成分。這形成了一個(gè)關(guān)鍵的區(qū)別。與其設(shè)計(jì)一種由未純化的“細(xì)胞壁”成分組成且只能檢測(cè)到內(nèi)毒素的“天然內(nèi)毒素”，不如設(shè)計(jì)一種由未純化的“細(xì)胞壁”成分組成的“天然內(nèi)毒素”，單個(gè)成分（內(nèi)毒素、磷脂、孔蛋白、鞭毛蛋白等）應(yīng)該有自己的檢測(cè)方法和標(biāo)準(zhǔn)，作為擴(kuò)大微生物污染控制能力。這將提供必要的冗余，而目前檢測(cè)亞細(xì)胞革蘭氏陰性細(xì)菌假象的全部權(quán)重都落在了內(nèi)毒素上。

雜質(zhì)測(cè)試的適當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)是分析測(cè)試的重要組成部分。根據(jù)USP <11>，標(biāo)記為“天然內(nèi)毒素”的雜質(zhì)混合物不是內(nèi)毒素，而是可能含有內(nèi)毒素、蛋白質(zhì)、磷脂、核酸和孔蛋白的混合物。今天基于鱟的測(cè)試是針對(duì)內(nèi)毒素的，而不是針對(duì)非內(nèi)毒素的細(xì)胞壁或細(xì)胞質(zhì)成分；這種特異性在鱟C因子和哺乳動(dòng)物TLR4檢測(cè)架構(gòu)中都是固有的。內(nèi)毒素的定義是一個(gè)跨學(xué)科的定義，不能隨便重新定義。

參考文獻(xiàn)
1. USP40-NF35 (Official as of 1-May-2018)

2. Wang X, Quinn, PJ. Lipopolysaccharide: Biosynthetic pathway and structure modification. Progress in Lipid Research 2010; 49: 97–107.

3. Ranf S. Immune Sensing of Lipopolysaccharide in Plants and Animals: Same but Different, PLOS Pathogens 2016.

4. Esparza et al. Endotoxin-albumin complexes transfer endotoxin monomers to MD-2 resulting in activation of TLR4, Innate Immunity, Innate Immun. 2012. 18(3): 478–491.

5. Ryu et al. Reconstruction of LPS transfer cascade reveals structural determinants within LBP, CD14, and TLR4-MD2 for efficient LPS recognition and transfer. Immunity 2017. 46, 38–50.

6. Berezin et al. Replacing a Century Old Technique – Modern Spectroscopy Can Supplant Gram Staining. Scientific Reports 2017. 7: 3810.

7. Henderson et al. The Power of Asymmetry: Architecture and Assembly of the Gram-Negative Outer Membrane Lipid Bilayer. Annu. Rev. Microbiol. 2016. 70:255–78. 

8. Ursell et al. Analysis of Surface Protein Expression Reveals the Growth Pattern of the Gram-Negative Outer Membrane. PLoS Comput Biol., v.8(9); 2012 Sept. PMC3459847`

9. Jaroslawski et al. High-resolution architecture of the outer membrane of Gram-negative bacteria Roseobacter denitrificans, Molecular Microbiology 2009. 74(5), 1211–1222.

10. Oestreicher, Taoka, and Fukumori. A comparison of the surface nanostructure from two different types of gram-negative cells: Escherichia coli and Rhodobacter sphaeroides, Micron 2015. 72, 8–14.

11. Koebnik R, Locher KP, Van Gelder P. Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell, Mol Microbiol. 2000 Jul;37(2):239-53.

12. Liu et al. Immunogenic characterization of outer membrane porins OmpC and OmpF of porcine extraintestinal pathogenic Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett 2012. 337: 104–111.

13. Pérez-Toledo M. Salmonella Typhi Porins OmpC and OmpF Are Potent Adjuvants for T-Dependent and T-Independent Antigens. Front Immunol. 2017. 8: 230.