褪黑素（melatonin，MLT）主要是由松果體分泌的一種吲哚類激素,具有明顯的晝夜節(jié)律性,分泌高峰在夜間,白天分泌減少,且合成與分泌受光/暗周期信號、神經(jīng)系統(tǒng)等因素的調(diào)節(jié)。本研究以正常成年大鼠為研究對象，將引導(dǎo)管置入前腦紋狀體內(nèi)，采用腦微透析技術(shù)動態(tài)收集透析液樣本，并采集大鼠尾靜脈血；用高效液相色譜‐熒光法測定大鼠體內(nèi)的MLT，并分析腦透析液與血清中MLT之間的相關(guān)性；同時用酶聯(lián)免疫法測定血清中MLT含量，比較2種檢測方法的一致性，為進一步了解體內(nèi)MLT的分泌模式、MLT含量的測定提供一種更為合理、有效的方法 。

腦微透析術(shù)及透析液樣本的收集

大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉（40mg/kg），固定于腦立體定位儀上。根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜，將微透析引導(dǎo)管置入右側(cè)紋狀體（ AP：+1.0mm， MR：+2.5mm，DV：-4.0mm），并用小螺絲和牙科水泥固定 ，靜養(yǎng)1周后進行腦微透析術(shù)。在收集腦透析液過程中每只大鼠均單獨進行，將大鼠放入清醒動物的自由活動裝置中，拔出引導(dǎo)針，插入微透析探針，用Ringers液(140 mmol/L NaCl ,4 mmol/L KCl，1.2 mmol/L CaCl₂，1 mmol/L MgCl₂ ,pH=7.4)平衡灌流1 h后,以2 μL/min 收集10 :00,14 :00,18 :00 ,22 :00,2 :.00和6 :00各時間點下大鼠安靜、清醒狀態(tài)下的透析液樣本，每個時間點收集3管，每管收集10min，樣本收集好后行色譜熒光法測定MLT含量，并取3管的平均值作為該時間點的MLT水平。在晚上收集樣本時注意避免白光，以免干擾MLT的晝夜節(jié)律。探針每次使用前先做探針體外回收率的測定，用以折算透析液樣本中MLT的濃度，并在透析后再次測定探針回收率，分析探針透析效能的變化。

血樣的采集及處理

于腦透析術(shù)后次日22:00 ,采集大鼠尾靜脈血液標(biāo)本1mL,4C靜置過夜,1000g離心20min,取上清。取50μL血清直接用ELISA法測定MLT含量，余下血清用三氯甲烷反復(fù)萃取,將三氯甲烷層真空干燥、氮氣吹干、最后殘留物用流動相溶解進樣,行色譜熒光法檢測MLT含量,并計算血清中MLT的提取回收率。

結(jié)果

1.MLT檢測方法的建立

與ELISA法相比，HPLC‐熒光法具有較低的檢出限值、呈較好的線性關(guān)系，日內(nèi)、日間精密度<6%，重現(xiàn)性較好，具有靈敏、快速、準(zhǔn)確的特點。（表1）

表 1  ２種褪黑素檢測方法的比較

2.大鼠腦透析液及血清中的MLT含量測定

(1)用色譜法測定探針透析前、后對MLT的回收率分別為(13.10士1.13 )%和(12.33士1.02)% ,兩者差別無統(tǒng)計學(xué)意義(n=6,P=0.508) ,提示探針對MLT透析效能比較穩(wěn)定。

(2)用熒光檢測器測定22 :00腦透析液及血清樣本中MLT ,色譜檢測結(jié)果（圖1）,MLT的分離效果良好,出峰時間在10min左右,22:.00血清中的MLT峰面積明顯高于腦透析液(n=8,P<0.001)。

圖1 HPLC檢測正常大鼠紋狀體透析液和血清中22：00的褪黑素水平

(3) HPLC - 熒光法測定2 : 00,6 : 00,10 : 00,14 : 00,18 : 00和22 : 00各時間點大鼠紋狀體腦透析液中的MLT含量分別為(32.99士2.22 ), (18.25土2.27 ),(4.03土1.70),(2.92士1.08 ),(12.08土1.77 )和(21.83土2 .04 )pg/mL,具有明顯的晝夜節(jié)律(圖2)。

 

圖2 紋狀體透析液褪黑素水平在2:00,6:00,10:00,14:00,18:00和22:00的波動情況

(4 ) HPLC - 熒光法測定22 : 00血清中的MLT含量為(82.62士8.09 )pg /mL ,提取回收率>90%,血清與透析液中的MLT含量具有高度正相關(guān)(r=0.987,P<0.001 )(圖3);ELISA測定血清中的MLT含量為(81.31士9 .62 )pg/mL,用2種方法測定血清中的MLT含量差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.115)。

圖3 腦透析液和血清中褪黑素水平的相關(guān)性

本研究結(jié)果表明，用改良的HPLC‐熒光檢測法測定大鼠腦透析液以及血清中的MLT含量簡單、快速、靈敏、準(zhǔn)確、重復(fù)性好、成本低，血清中MLT和腦內(nèi)MLT具有很好的相關(guān)性，且 HPLC‐熒光法和ELISA法測定血清MLT具有較好的一致性，為探究體內(nèi)MLT分泌模式、測定MLT含量提供一種有效的方法 。 

文章來源:福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報：成年大鼠腦透析液和血清中褪黑素含量的測定，孟 濤１ ，２ ，鄭志竑１ ，葉 婧１ ，林 玲１

 

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