局部晚期非小細(xì)胞肺癌(LA-NSCLC)患者在臨床診療中占比相對較高、預(yù)后較差且異質(zhì)性較大，年生存率僅在15%-30%。放療是LA-NSCLC主要局部治療手段，然而放療抵抗嚴(yán)重限制了臨床患者整體療效。因此，尋找放療敏感性相關(guān)標(biāo)志物及信號通路，為臨床個體化治療提供依據(jù)尤為重要。

上海交大附屬胸科醫(yī)院團(tuán)隊利用DIA組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)NSCLC放射敏感性標(biāo)志物。2021年，上海交通大學(xué)附屬胸科醫(yī)院傅小龍教授課題組在International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics（IF 7.038）雜志上發(fā)表題目為 "Radiosensitivity-specific proteomic and signaling pathway network of non-small cell lung cancer"的研究成果，利用DIA蛋白組學(xué)技術(shù)在NSCLC細(xì)胞系和臨床組織中深入研究NSCLC放射敏感性的潛在分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)并驗證了放射敏感性蛋白標(biāo)志物。中科新生命為本研究提供了DIA蛋白組學(xué)的技術(shù)支持。

研究材料
NSCLC細(xì)胞系和組織石蠟切片
 
技術(shù)路線
步驟1：NSCLC細(xì)胞系蛋白組分析尋找放射敏感性相關(guān)蛋白及通路；
步驟2：NSCLC患者組織蛋白組分析研究放射敏感性標(biāo)志蛋白及通路；
步驟3：NSCLC放射敏感性蛋白的功能驗證；
步驟4：NSCLC放射敏感性蛋白臨床驗證與數(shù)據(jù)分析。
 
研究結(jié)果

1. 非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系的蛋白質(zhì)組學(xué)研究
為獲得非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）細(xì)胞系的蛋白質(zhì)組，作者篩選出29個人NSCLC細(xì)胞系，利用DIA蛋白組技術(shù)共檢測到6876個蛋白質(zhì)，其中3371個蛋白質(zhì)在所有細(xì)胞中均有表達(dá)。3371個共有蛋白的GO和KEGG分析表明，NSCLC蛋白主要富集在代謝和生物合成通路、細(xì)菌或病毒感染相關(guān)通路以及人類疾病相關(guān)的信號通路中。綜上，NSCLC的發(fā)生可能與細(xì)胞代謝、生物合成紊亂以及細(xì)菌或病毒感染有關(guān)。

 
2.NSCLC放射敏感性蛋白及通路篩選
作者通過放射后克隆存活來分析29個人NSCLC細(xì)胞系的放射敏感性（SF2），相關(guān)性分析找到SF2顯著相關(guān)的27個放射敏感性蛋白，對27個蛋白進(jìn)行PPI分析，確定了595個與放射敏感性蛋白相互作用的蛋白。對上述622個互作蛋白的GO和KEGG分析發(fā)現(xiàn)，這些蛋白主要與細(xì)胞鈣粘附素結(jié)合、連接酶、蛋白質(zhì)結(jié)合以及各種酶活性有關(guān)，主要富集于先前報道的放射敏感性相關(guān)信號通路（VEGF、ErbB、HIF-1和EGFR7）。綜上，NSCLC的放射敏感性與細(xì)胞間的粘附和細(xì)胞運(yùn)動有關(guān)。

 
3. 組織石蠟樣本中放射敏感性蛋白和富集通路分析
為了驗證NSCLC細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)的放射敏感性通路，作者進(jìn)一步用DIA蛋白組技術(shù)檢測了12個石蠟包埋的人NSCLC樣本，共鑒定出5511個蛋白質(zhì)。石蠟樣本共有的蛋白有2563個，其中1753個在NSCLC細(xì)胞系也鑒定到。此外石蠟樣本共有的2563個蛋白質(zhì)的GO和KEGG分析結(jié)果與NSCLC細(xì)胞系的一致。根據(jù)患者的局部無進(jìn)展生存(LPFS)時間，12例石蠟標(biāo)本被分為兩組：放射響應(yīng)好(RRG；LPFS≥1.5年)和放射響應(yīng)差(RRP；LPFS<1.5年)。無監(jiān)督層次聚類和PCA分析顯示RRG和RRP組可以很好地分離。與RRG 相比，RRP組有44個蛋白質(zhì)差異表達(dá)，PPI分析獲得1015個放射敏感性相關(guān)蛋白。GO和KEGG分析表明，NSCLC細(xì)胞系與石蠟樣本間有38條與放射敏感性相關(guān)的信號通路重疊。重疊的通路中的22個差異蛋白與NSCLC的放射敏感性相關(guān)，PPI分析顯示，關(guān)鍵的中樞蛋白ILK、IQGAP1和PAK1形成互作網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)中8種蛋白（ILK、IQGAP1、PAK1、IQGAP2、STAT1、STAT5B、HSPA2和Bag2）的表達(dá)與SF2呈正相關(guān)，表明8種蛋白的高表達(dá)可能誘導(dǎo)NSCLC產(chǎn)生放射抗性。

圖3 NSCLC石蠟樣本中的放射敏感性蛋白和富集途徑

 
4. 放射敏感性相關(guān)蛋白在NSCLC細(xì)胞系中的表達(dá)驗證
通過Western blot、免疫熒光和qPCR驗證了NSCLC細(xì)胞系中差異表達(dá)的8個蛋白在放射抵抗細(xì)胞中表達(dá)水平都增加。為了確定找到的放射敏感性相關(guān)蛋白是否在放射抗性中發(fā)揮作用，作者對ILK、IQGAP1和PAK1三種關(guān)鍵的中樞蛋白的功能進(jìn)行了驗證，發(fā)現(xiàn)單基因敲除的NSCLC細(xì)胞中放射誘導(dǎo)的凋亡比例增加，有顯著的放射增敏作用。

圖4 NSCLC放射敏感性蛋白的表達(dá)驗證

 
5. NSCLC患者放射敏感性相關(guān)蛋白的驗證
為進(jìn)一步驗證放射敏感性相關(guān)蛋白在臨床患者中的表達(dá)，作者選取13例接受根治性放療的NSCLC患者的石蠟標(biāo)本，免疫組化顯示，6個蛋白ILK、IQGAP1、PAK1、IQGAP2、STAT1和STAT5B在RRP患者中高表達(dá)。生存分析顯示6個蛋白的表達(dá)與接受根治性放療的NSCLC患者的LPFS相關(guān)，證明了這6個蛋白作為放射敏感性標(biāo)志物的潛力。

 
6. NSCLC放射敏感性的信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)
結(jié)合前人的研究和本研究結(jié)果，作者推測非小細(xì)胞肺癌放射敏感性的機(jī)制可能與ILK、PAK1和IQGAP1有關(guān)：細(xì)胞中高濃度的ILK激活I(lǐng)QGAP1，促進(jìn)IQGAP1-rac1/Cdc42復(fù)合物的形成。活化的CdC42誘導(dǎo)PAK1下游效應(yīng)蛋白的磷酸化。磷酸化的PAK1通過抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步激活Snail，促進(jìn)PAK1/Snail復(fù)合物的形成，從而誘導(dǎo)EMT和放射抗性。

圖6 NSCLC放射敏感性的信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

 

 
 小編小結(jié)
本研究利用DIA蛋白組學(xué)檢測技術(shù)建立了NSCLC細(xì)胞系和腫瘤石蠟組織的蛋白質(zhì)組圖譜，從中發(fā)現(xiàn)并驗證了非小細(xì)胞肺癌放射敏感性特異蛋白，描繪了非小細(xì)胞肺癌放射敏感性相關(guān)信號通路的圖譜網(wǎng)絡(luò)。本研究不僅加深了我們對非小細(xì)胞肺癌放射敏感性機(jī)制的理解，篩選到的NSCLC放射敏感性的蛋白標(biāo)志物也為臨床個體化放療提供了新的方向。