Figure 1.  來自恥垢分支桿菌 MMPL3 蛋白的總體結構

隨后，研究團隊分別解析了 MMPL3 蛋白與四種抑制劑（SQ109、AU1235、ICA38 和 Rimonabant）復合物結合的晶體結構，通過 MST（microscale thermophoresis）實驗測得 SQ109、AU1235、ICA38 和 Rimonabant 四種抑制劑和 MMPL3 蛋白結合的 Kd 值分別是 1.65 μM、0.29 μM、0.16 μM 和 29.5 μM。

SQ109 是很有潛力的抗結核藥物，具有廣譜的抗菌活性，對結核分枝桿菌和恥垢分枝桿菌的 MIC 值分別為 0.3-0.6 μM 和 9.6 μM，目前已完成臨床 II-III 期試驗。研究證實了 MMPL3 是 SQ109 的直接靶點，SQ109 作用于 MMPL3 蛋白的跨膜結構域，嵌入 TMH 束中心，被 TMH IV、V、VI、X、XI、XII 所包圍（圖2A），破壞質子傳遞中的 Asp-Tyr 對，阻斷該蛋白的質子內流通道，導致 MMPL3 的構象重排（圖2）。
 

 Figure 2. SQ109 結合后引起 MMPL3 的構象重排

AU1235 對分枝桿菌和恥垢分枝桿菌的 MIC 值分別為 0.6 μM 和 9.8 μM。研究發(fā)現(xiàn) AU1235 與 SQ109 在同一個口袋中結合。此外， AU1235 的結合模式與 SQ109 的結合模式相似。在結合時，AU1235 在 MMPL3 中誘導了與  SQ109 非常相似的構象變化。兩個抑制劑和 MMPL3 蛋白結合的差異在于 AU1235 中的三氟苯基具有更強的疏水作用。

ICA38 對分枝桿菌的 MIC 值為 0.003 μM。由于 ICA38 的生物利用度較差，不適合作為候選藥物進一步開發(fā)，其衍生物 NITD-304 和 NITD-349 已被證明是很有潛力的治療耐藥結核病的臨床前候選藥物。研究發(fā)現(xiàn)，ICA38 結合 MMPL3 的模式和 AU1235、SQ109 相似。與 AU1235 和 SQ109相比，ICA38 的吲哚基團緊貼在通道頂部的疏水亞位點，產生的疏水作用強于 SQ109 和 AU1235。

作者還對成藥庫的藥物分子進行了篩選，驚喜發(fā)現(xiàn) Rimonabant 有可能是 MMPL3 蛋白的抑制劑。Rimonabant 是首個針對人源大麻素受體 CB1 的拮抗劑，具有治療肥胖癥的潛力。通過分析 Rimonabant 與 MMPL3 蛋白復合物的晶體結構，作者證實了 MMPL3 蛋白是 Rimonabant 的直接靶點。結構顯示，Rimonabant 阻斷了 MMPL3 的質子內流通道。

為了更加清楚形象的解釋 Rimonabant 的結合模式，作者將 Rimonabant 的 2,4 -二氯苯基環(huán)簡稱為“臂1”，4-氯苯基環(huán)簡稱為“臂2”，哌啶酰-1-氨基甲酰簡稱為“臂3”（圖 3D）。吡唑環(huán)(包括4-甲基)插入 TMH 束的中心，垂直于膜，與疏水殘基 Gly641、Leu642 和 Ile253 相互作用（圖 3C 和 D）。“臂1”占據了一個由 5 個脂肪族氨基酸側鏈包圍的疏水口袋（圖 3C 和 D）。“臂2”與 SQ109 的香葉尾方向不同，伸入鄰近的、由 Val245、Ile319、Val638 和 Leu708 側鏈形成的疏水亞位點（圖3 A、C 和 D）。“臂3”插入兩個 Asp-Tyr 對的中心，并通過與 Asp645 形成極性相互作用而破壞連接它們的氫鍵。當 Phe649 的苯環(huán)向下旋轉面向 Phe260 的芳香環(huán)時，Phe260 幾乎不受干擾，形成 π-π 相互作用（圖3C 和 E）。Rimonabant 與 MMPL3蛋白的這種結合模式不同于 SQ109 等抑制劑，與結合 CB1 受體的模式也極其不同。
 

 Figure 3.  Rimonabant 與 MMPL3 結合的獨特模式

SQ109、AU1235、ICA38 和 Rimonabant 這四種抑制劑均結合在質子傳遞通道中，該研究對這個結合口袋進行了分區(qū)，分為 S1、S2、S3、S4 和 S5 五個亞區(qū)。其中，SQ109、AU1235 和 ICA38 結合模式相似，占據了 S3、S4、S5 三個亞區(qū) (圖7B-D)，而 Rimonabant 比較特別，它還占據了 S1 和 S2 亞區(qū) (圖 4E)。這種藥物結合的結構特點，對于抑制 MMPL3 這一靶點蛋白的抗結核藥物設計具有非常重要的指導作用。除了 S4 亞位點外，S1、S2、S3、S5 都是疏水的。S1 和 S2 相對較小，而 S3 和 S5 都比較大，足以容納大型疏水基團以增強結合(圖 4A)。這兩個 Asp-Tyr 對是 S4 亞位點的關鍵組件 (圖 4A)。四種候選藥物在結合時分別占據質子傳遞通道的 3-5 個子位點 (圖 4B -4E)，破壞質子傳遞通道中的 Asp-Tyr 對，從而阻斷底物轉運的質子動力。圖中結構信息的展示代表針對 MMPL3 蛋白有效抑制劑設計的一個重大進展。重要的是，這些結構數據和 MMPL3 活性化合物的 Kd 值表明，這些活性化合物在成為高效抗結核藥物之前還有很大優(yōu)化空間。
 

 Figure 4.  MMPL3 質子傳遞通道的口袋分區(qū)（SQ109：洋紅色棒；AU1235：綠色棒；ICA38：橙色棒；Rimonabant：黃色棒)

小M 的小思考：
此外，為了研究抗藥突變對抑制劑結合的影響，作者分析了 13 個已知的 SQ109、AU1235 和 ICA38 衍生物突變位點，其中，Y257C 是暴露于 SQ109 和AU1235 的雙抗性突變。MST 數據顯示，這些抑制劑和突變蛋白的結合非常弱，這是因為 Tyr257 在穩(wěn)定親水性 S4 亞位點和增強 S5 亞位點與抑制劑結合中發(fā)揮了重要作用。同樣的，Ser293 突變?yōu)楸�氨酸嚴重破壞�?SQ109 和 AU1235 與 MMPL3 靶蛋白的結合。諸如此類的突變如何產生耐藥性仍有待進一步研究，但避免與這些產生耐藥性的突變殘基直接接觸是設計 MMPL3 二代抑制劑的一個合理策略，而另一個策略則是設計藥物構象時注入靈活可變性（例如，更自由的可旋轉鍵）^[1]。

參考文獻
[1] Tuberculosis. WorldHealth Organization. 16 February 2018. https://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/tuberculosis.
[2] Zhang B，et al. Crystal Structures of Membrane TransporterMmpL3, an Anti-TB Drug Target. Cell. 2019 Jan 24; 176(3):636-648.e13.

相關產品：
HY-14136
Rimonabant(SR141716) 是中心大麻素 1 (CB1) 受體高效的、選擇性的反向激動劑， K_i 值為 1.8 nM。Rimonabant (SR141716) 也能夠抑制分枝桿菌膜蛋白3 (MMPL3).