主動(dòng)脈瘤和夾層（AAD）是高風(fēng)險(xiǎn)的心血管疾病，目前還沒有有效的藥物可以預(yù)防AAD的發(fā)生和發(fā)展。巨噬細(xì)胞在AAD的發(fā)展中起重要作用。而琥珀酸鹽會(huì)引發(fā)巨噬細(xì)胞的炎癥變化。北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院心血管研究所鄭樂民教授團(tuán)隊(duì)與華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院汪道文團(tuán)隊(duì)首次報(bào)道琥珀酸可以作為AAD診斷的新型生物標(biāo)志物，血漿中高濃度琥珀酸加重小鼠AAD的進(jìn)展，抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)琥珀酸生成通路p38α-CREB-OGDH軸，有效抑制琥珀酸積累，緩解AAD的進(jìn)展，為AAD的治療提供新的靶點(diǎn)。相關(guān)成果發(fā)表于《European Heart Journal》。

研究重點(diǎn)解析

(1)琥珀酸是發(fā)現(xiàn)隊(duì)列中上調(diào)最顯著的代謝物；這在驗(yàn)證隊(duì)列中得到證實(shí)。

(2)血漿琥珀酸濃度可區(qū)分AAD患者、急性心肌梗死(AMI)、肺栓塞(PE)患者和健康對(duì)照。

(3)琥珀酸給藥加重了小鼠血管緊張素 II 誘導(dǎo)的 AAD 和血管炎癥。

(4)氧代戊二酸脫氫酶(OGDH)的敲低降低了巨噬細(xì)胞中炎癥因子的表達(dá)。 

(5)巨噬細(xì)胞中的琥珀酸濃度由 p38α-CREB-OGDH 軸調(diào)節(jié)。

1. 代謝組學(xué)揭示主動(dòng)脈疾病患者血漿琥珀酸濃度升高

在發(fā)現(xiàn)隊(duì)列中，納入20例主動(dòng)脈疾病患者（包括5名A型AD（主動(dòng)脈夾層）、7名B型AD和8名AAA（腹主動(dòng)脈瘤））以及20例年齡、性別和合并癥匹配（包括吸煙和飲酒狀況，以及高血壓和糖尿病史）的健康對(duì)照，進(jìn)行代謝組學(xué)。結(jié)果顯示，在所有主動(dòng)脈疾病患者和健康對(duì)照之間有119種代謝物存在顯著差異。其中，琥珀酸是上調(diào)最顯著的代謝物。

在驗(yàn)證隊(duì)列中，納入1665例個(gè)體，包括700例主動(dòng)脈疾病病例（241名A型AD、374 名B型AD和85名AAA）、199名AMI 病例、74名PE病例和692名健康對(duì)照，通過靶向代謝方法進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，與健康對(duì)照者相比，主動(dòng)脈疾病患者的琥珀酸濃度升高。與發(fā)現(xiàn)集中的結(jié)果保持一致，A型AD、B型AD和AAA患者的琥珀酸水平較高。隨后對(duì)兩個(gè)隊(duì)列數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析，發(fā)現(xiàn)血漿琥珀酸濃度較高的個(gè)體患主動(dòng)脈疾病的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。對(duì)年齡、性別、吸煙和飲酒習(xí)慣、高血壓和糖尿病史以及收縮壓等常見危險(xiǎn)因素校正后，血漿琥珀酸濃度仍然是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)測因子（圖1）。

2. 血漿琥珀酸濃度對(duì)主動(dòng)脈疾病的診斷性能

使用受試者工作特征曲線下面積 (AUROC) 評(píng)估琥珀酸預(yù)測AAD的能力，曲線下面積為0.83，比基線（包括年齡、性別、吸煙、飲酒、高血壓病史、和糖尿病和收縮壓）模塊（AUROC = 0.79，）具有更好的判別性能。此外，基線加琥珀酸組合AUROC（0.87）在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有更高的判別性能。同時(shí)，決策曲線分析（DCA）是一種用于評(píng)估替代診斷策略的新方法，與AUROC方法相比具有優(yōu)勢。DCA分析結(jié)果與AUROC保持一致，以上研究表明血漿琥珀酸測試具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。

主動(dòng)脈疾病、AMI和PE是具有相似癥狀但需要不同治療策略的疾病。因此，區(qū)分這三種疾病至關(guān)重要。招募199名 AMI患者和76名PE患者，以確定是否有任何生化參數(shù)可以可靠地區(qū)分主動(dòng)脈疾病與AMI和PE。結(jié)果表明，與AMI患者和PE患者相比，主動(dòng)脈疾病患者的血漿琥珀酸濃度顯著增加。AMI和PE患者與健康對(duì)照的AUROC值分別為0.63和0.53。主動(dòng)脈疾病患者與AMI和PE患者的AUROC值分別為0.9和0.80。因此，血漿琥珀酸濃度具有很好的診斷性能，且能區(qū)分主動(dòng)脈疾病患者與健康對(duì)照以及AMI和PE患者（圖1）。

圖1 琥珀酸可以提高主動(dòng)脈疾病的診斷性能

3. 琥珀酸加劇小鼠AAD的形成

為確定琥珀酸在AAD中的作用，向小鼠施用琥珀酸或空白對(duì)照載體，并構(gòu)建BAPN/血管緊張素II（Ang II）誘導(dǎo)的第一個(gè)AAD模型。結(jié)果顯示，琥珀酸給藥增加了小鼠死亡率（41.7%對(duì)71.4%）、AAD發(fā)生率（67% 對(duì) 100%），且在第31天時(shí)增加了升主動(dòng)脈、主動(dòng)脈弓和降主動(dòng)脈的直徑，由于琥珀酸組中僅剩下3只小鼠，無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性結(jié)果。與空白對(duì)照組相比，琥珀酸給藥增加了主動(dòng)脈病理狀況，也增加了脈管系統(tǒng)中ROS的水平。給Apoe^–/–小鼠施用琥珀酸或空白對(duì)照，然后注射Ang II 28天誘導(dǎo)第二個(gè)AAD模型。結(jié)果線上，與空白對(duì)照相比，琥珀酸給藥增加AAD發(fā)生率（60% 到100%）。與對(duì)照小鼠相比，琥珀酸給藥小鼠的最大主動(dòng)脈直徑顯著增加。值得注意的是，本研究進(jìn)一步證實(shí)補(bǔ)充琥珀酸會(huì)加重BAPN誘導(dǎo)的 AAD（第三個(gè)AAD模型）。接受含有1.5%琥珀酸鹽水的小鼠AAD的發(fā)生率增加，主動(dòng)脈直徑增加。（圖 2）

圖2 補(bǔ)充琥珀酸在體內(nèi)加重主動(dòng)脈瘤和夾層

4. 抑制酮戊二酸脫氫酶可減少巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥

據(jù)報(bào)道，與脂多糖 (LPS) 一起孵育的巨噬細(xì)胞中琥珀酸濃度增加，從而促進(jìn) IL-1b 表達(dá)并增強(qiáng)促炎巨噬細(xì)胞反應(yīng)。巨噬細(xì)胞可以將琥珀酸釋放到細(xì)胞外環(huán)境中。在TCA循環(huán)中，琥珀酸是通過由氧代戊二酸脫氫酶(OGDH)介導(dǎo)的α-酮戊二酸氧化脫羧合成的。已證明 LPS 刺激后巨噬細(xì)胞中的OGDH活性顯著增加，促進(jìn)琥珀酸的積累。AAD組織切片結(jié)果顯示，巨噬細(xì)胞中OGDH顯著增加，表明OGDH可能在AAD中發(fā)揮重要作用。通過siRNA敲低 Ogdh基因減輕了用LPS刺激24小時(shí)的骨髓源性巨噬細(xì)胞(BMDM)的炎癥，同時(shí)Il1b和 Nos2 的mRNA表達(dá)水平降低，OGDH和pro-IL-1b的蛋白表達(dá)水平降低。Ogdh敲低后琥珀酸的濃度顯著降低。此外，琥珀酰膦酸酯（一種OGDH的特異性抑制劑）處理后，在Il1b和 Nos2的mRNA表達(dá)水平下調(diào)，pro-IL-1b 的蛋白含量表達(dá)下調(diào)（圖3）。

圖3 抑制OGDH可降低巨噬細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)

5. CREB調(diào)控Ogdh 轉(zhuǎn)錄

根據(jù)染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）-seq數(shù)據(jù)庫（http://rna.sysu.edu.cn/chipbase3/），轉(zhuǎn)錄因子環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白1（CREB）可以與Ogdh啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合。雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，CREB的過表達(dá)導(dǎo)致Ogdh啟動(dòng)子激活。根據(jù) ChIP 分析，CREB與BMDM中Ogdh的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合。為證明CREB調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞中的OGDH表達(dá)，使用siRNA敲低Creb1 基因，從而降低LPS處理的BMDM中的OGDH和pro-IL-1b表達(dá)水平。在與選擇性CREB抑制劑666-15孵育的BMDM中獲得了類似結(jié)果。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，AAD中巨噬細(xì)胞中CREB的磷酸化（p-CREB）水平在顯著增加。此外，在三個(gè)獨(dú)立的公共主動(dòng)脈疾病數(shù)據(jù)庫中，CREB和OGDH的表達(dá)水平呈現(xiàn)顯著正相關(guān)（圖4）。

圖4  CREB通過直接啟動(dòng)子結(jié)合調(diào)節(jié)OGDH 表達(dá)

6. p38α對(duì)CREB的磷酸化促進(jìn)琥珀酸產(chǎn)生和巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)

CREB是一種廣泛表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，其活性受多種激酶的調(diào)控。已報(bào)道，在 LPS 刺激下，CREB被p38α磷酸化。本文進(jìn)一步研究了p38α在調(diào)節(jié)琥珀酸產(chǎn)生中的作用。通過將 p38α-flox 小鼠p38α^fl/fl與LysM-Cre小鼠雜交獲得p38α髓樣缺失小鼠p38α^MKO。結(jié)果顯示，與p38α^fl/fl小鼠相比，p38α^MKO小鼠的LPS處理的BMDM中p-CREB水平更低，驗(yàn)證了p38α在LPS刺激后磷酸化CREB的觀點(diǎn)。免疫沉淀實(shí)驗(yàn)表明，p38α結(jié)合到CREB上。p38α缺失在mRNA和蛋白質(zhì)水平下調(diào)了OGDH的表達(dá)，并且降低了BMDM中琥珀酸的含量。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)p38α^MKO小鼠BMDMs中pro-IL-1b的表達(dá)低于p38α^fl/fl小鼠。在p38α缺失小鼠中LPS刺激的BMDM中炎癥因子表達(dá)降低，包括編碼巨噬細(xì)胞促炎因子（Nos2、Hif1a、Il1b、Ccl2）的基因表達(dá)水平降低，并且M1促炎巨噬細(xì)胞的比例和細(xì)胞內(nèi)ROS的表達(dá)水平均降低（圖5）。

圖5 p38α通過CREB磷酸化調(diào)節(jié)OGDH和琥珀酸的表達(dá)來影響巨噬細(xì)胞炎癥表型

 

7. 巨噬細(xì)胞中p38α缺失減弱了AAD的形成

用p38α 條件特異性抑制劑SB203580處理野生型小鼠。該化合物抑制了彈性蛋白酶誘導(dǎo)的AAA的進(jìn)展。將p38α^MKO和p38α^fl/fl小鼠與Apoe^–/–小鼠雜交以獲得 p38α^MKO Apoe^–/– 和 p38α^fl/fl Apoe^–/– 小鼠。結(jié)果顯示，與野生型同窩小鼠相比，注入Ang II的 p38α^MKO Apoe^–/– 小鼠AAD的發(fā)生率降低，主動(dòng)脈直徑變短。H&E染色顯示，p38α^MKO Apoe^–/– 小鼠的壁厚和平滑肌細(xì)胞的損失少于其野生型同窩小鼠。EVG染色顯示，巨噬細(xì)胞中p38α的缺失抑制了彈性蛋白的降解。在p38α^MKO Apoe^–/–小鼠中，AAD中的巨噬細(xì)胞浸潤降低，尤其是M1促炎巨噬細(xì)胞，表明主動(dòng)脈炎癥減弱。在注入 Ang II 3天或7天的小鼠中也觀察到一致現(xiàn)象。此外，免疫組織化結(jié)果顯示，與 p38α^fl/f Apoe^–/– 小鼠相比，p38α^MKO Apoe^–/– 小鼠的主動(dòng)脈炎癥因子，如MMP9、IL-6、單核細(xì)胞趨化蛋白-1 MCP1、TNF-a和IL-1b的表達(dá)水平降低（圖6）。

圖6 巨噬細(xì)胞特異性 p38α 缺失減弱血管緊張素 II 誘導(dǎo)的AAD

小結(jié)

本研究通過代謝組學(xué)測定了40名和1665名發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證組個(gè)體的血漿琥珀酸濃度，發(fā)現(xiàn)主動(dòng)脈夾層和主動(dòng)脈瘤等主動(dòng)脈疾病患者的血漿琥珀酸顯著升高。而抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)琥珀酸生成通路p38α-CREB-OGDH軸，有效抑制琥珀酸積累，進(jìn)而緩解AAD的進(jìn)展。該研究發(fā)現(xiàn)血漿琥珀酸能作為診斷AAD的新型標(biāo)志物，琥珀酸相關(guān)信號(hào)通路有望成為治療AAD的潛在靶點(diǎn)。

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參考文獻(xiàn)

Untargeted metabolomics identifies succinate as a biomarker and therapeutic target in aortic aneurysm and dissection. European Heart Journal.2021.https://doi.org/10.1093/eurheartj/ehab605.

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