蛋白純化實驗設計和抗體選擇
小 M 不怕純化“難”，IP、WB 只等閑。泡了兩年實驗室的小 M，理論與實操經(jīng)驗共有，且看我如何闖過蛋白純化的幾道“關”。
小 M 敲黑板：此關最基礎也最重要，謹防“一步錯，步步錯”。
親和層析作為經(jīng)典、高效的純化方法，利用目的分子與填料配基之間特異且可逆的相互作用，可以從細胞裂解液或其他生物樣品中，一步純化得到較高純度目的分子。選擇一款合適的親和純化瓊脂糖，可以高效、便捷、可靠地從生物樣品中分離蛋白、抗體。如何選擇才叫“合適”？且聽我慢慢道來：
■ 抗體基礎知識篇，“知己知彼百戰(zhàn)百勝”
抗體 (Antibody)，又名免疫球蛋白 (Immunoglobulin，Ig)，是一種由 B 細胞產(chǎn)生的大型 Y 形糖蛋白�？贵w以一個或多個 Y 形單體存在，每個 Y 形單體由 4 條多肽鏈組成：兩條相同的重鏈 (Heavy Chain) 和兩條相同的輕鏈 (Light Chain) (圖 1)。
抗體重鏈 Fc 區(qū)域的特異性序列決定了 Ig 的類型，如 α-IgA、δ-IgD、ε-IgE、γ-IgG、μ-IgM。輕鏈則有兩種類型，分別為 λ 型和 κ 型。
圖 1. 抗體結(jié)構(gòu)
■ 抗體——配體要相配！
心心念念純化人源 IgG3，一通操作后，目的條帶位置空空如也。最后發(fā)現(xiàn)，當初選擇了 Protein A 當親和配體。人源 IgG3 和 Protein A，不相配！λ 輕鏈和 Protein L，不相配！蛋白純化也講究門當戶對。抗體的親和純化配體包括 Protein A、Protein G、Protein L 等。對于多數(shù)哺乳動物，Protein G 比 Protein A 對 IgG 有更高的親和力，如人 IgG3、小鼠 IgG1 和大鼠 IgG2a，但 Protein G 不能和人的 IgM、IgD、IgA 等結(jié)合。
與 Protein A、Protein G 相比，Protein L 具有更廣譜的 Ig 結(jié)合能力，幾乎可結(jié)合所有含有 kappa 輕鏈的 Ig (IgG、IgM、IgA、IgE 和 IgD) 及單鏈可變片段 (scFv) 和 Fab 片段。謹記根據(jù)抗體類型，選擇合適的親和純化配體 (圖 2)。
圖 2. 人源抗體與 Protein A、Protein G、Protein L 結(jié)合能力對照表
MCE Protein A、Protein G、Protein L 瓊脂糖，可從血清、細胞培養(yǎng)上清液或腹水中一步分離抗體；Anti-Flag 親和凝膠 可通過 IP 等方法捕獲目的蛋白；鏈霉親和素瓊脂糖 則可和生物素化樣本高效結(jié)合。
抗體純化“大”實驗，IP、Pull Down“小”操作，重力柱“大”而離心管“小”焉。殺雞焉能用宰牛刀，產(chǎn)品詳細使用方法奉上 (如下方案僅供參考，詳見各產(chǎn)品使用說明)。
■ 重力過柱法，適合從血清等生物樣本中分離、純化抗體。一次實驗獲得大量抗體，妙！
1）裝填：根據(jù)樣品量取適量的瓊脂糖填料加入親和層析柱，讓儲存液靠重力流出；
2）平衡：隨后用平衡 Buffer 對柱子進行平衡；
3）上樣、洗雜：將樣品上到平衡好的柱子上后，繼續(xù)用平衡 Buffer 進行雜質(zhì)的清洗和去除。
4）洗脫：最后用洗脫 Buffer 將目的樣品洗脫。
■ 離心法，適合通過 IP 捕獲蛋白或研究蛋白-蛋白間相互作用。精細化操作，穩(wěn)！
將 Anti-Flag 親和凝膠吸入離心管，使用離心法操作。離心的方式同樣經(jīng)平衡 → 上樣 → 洗雜 → 洗脫四個步驟，前三個步驟 Buffer 的置換通過離心棄掉上清來實現(xiàn)，最后洗脫時離心收集上清。
圖 4. Anti-Flag Affinity Gel 的使用步驟
Input 明明有目的蛋白，目的蛋白明明已結(jié)合，但洗脫液中卻沒有目的條帶。
巧設對照，巧留樣，蛋白洗脫，我在行。
■ 巧婦難為無米之炊，想讓我“無中生有”？No Way！
檢測結(jié)果無條帶，也許是以下原因。
PS：設置 Input 對照，確定目的蛋白已表達；保留上樣后的流出液/離心后上清液，確定樣本已結(jié)合。每步操作“留一手”，全面復盤 (分析實驗失敗原因) 有幫助。
■ “變性”？“非變性”？下游實驗應用來決定
1）變性洗脫法 此方法洗脫的蛋白樣品后續(xù)可直接做 SDS-PAGE 檢測，簡便、高效。
2）非變性洗脫法 此方法洗脫的蛋白樣品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析。常用的有酸性洗脫法，低 pH 水平可以解離大多數(shù)抗體-抗原相互作用。
■ 洗脫后雜帶多、純度低
面對這個棘手的問題，我們首先需要分析雜蛋白的來源：是來自于目的蛋白的降解產(chǎn)物？與填料的吸附？還是與目的蛋白的互作？
1）蛋白部分降解：使用恰當?shù)?/SPAN>蛋白酶抑制劑；如對于低 pH 環(huán)境很敏感，需在洗脫前的接收管中提前加入中和液。
2）蛋白非特異性結(jié)合在抗體、凝膠或離心管壁上，建議對裂解液進行預處理，去除非特異性蛋白；在最后一次洗滌前，將樣品轉(zhuǎn)移到新的離心管中操作；洗滌效果不佳，建議增加洗滌時間及次數(shù)，增加洗滌 Buffer 中 NaCl 或去垢劑的濃度等。
這里來抄個作業(yè)，3、2、1，上鏈接我就不信這個邪！打破 Western Blot 玄學操作。
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