小分子降解劑分子膠的應(yīng)用
小分子降解劑通過介導(dǎo)泛素化連接酶與靶蛋白的識別，對靶蛋白進行降解。目前蛋白降解劑主要有兩類，一類是雙功能分子降解劑，通常稱為 PROTAC (蛋白水解靶向嵌合體)，通過泛素-蛋白酶體途徑特異性地降解靶蛋白。另一類是 “分子膠” (Molecular glues)，也是通過結(jié)合泛素化連接酶，但與 PROTAC 不同的是，分子膠是通過修飾泛素化連接酶表面，從而識別并降解全新底物 (Neo-substrate)。例如磺胺類抗腫瘤藥 (Indisulam); 和免疫調(diào)節(jié)藥物 (IMiDs) 沙利度胺 (Thalidomide)、來那度胺 (Lenalidomide)。
理論來說，PROTAC 分子既可以作為 PROTAC 降解劑來結(jié)合和降解靶蛋白，也可以充當(dāng) “分子膠” 降解新底物。最近就發(fā)現(xiàn)一類鄰苯二甲酰亞胺共軛的 PROTAC 降解劑其實是以分子膠的方式起作用，例如 MG-277。另外，最近 Benjamin Cravatt 團隊開發(fā)出一種新型的“分子膠”。這類“分子膠”是以共價修飾 E3 連接酶 DCAF16 的方式，特異性促進核蛋白降解。
PROTAC “變身” 分子膠
MG-277 是對 MD-222 (PROTAC MDM2 降解劑) 進行了簡單的結(jié)構(gòu)修飾而來的。但正是這一小步的修飾，卻帶來了完全不同的靶向降解 “結(jié)局”。
MG-277: MD-222 抑制劑部分的 MI-1061 的苯甲酸被甲基取代
首先，不同于 MD-222 對野生型 p53 (人白細胞 RS4;11) 的選擇性，MG-277 對攜帶野生型，突變 p53 (RS4;11/IRMI-2 細胞) 或缺失 p53 的癌細胞系都有抑制作用，而且在誘導(dǎo) MDM2 降解方面要比 MD-222 要低得多，且不能激活野生型 p53。通過敲除 MDM2 等試驗發(fā)現(xiàn)，MG-277 的對細胞的抑制作用不僅不依賴 MDM2，本身也不與 MDM2 結(jié)合。
MG-277 對細胞的抑制活性，到底從何而來？
通過對 MG-277 中的戊二酰亞胺的氨基 (與 cereblon 結(jié)合相關(guān)) 甲基化，即合成了 MC-024，發(fā)現(xiàn) MC-024 在抑制細胞 (RS4;11，RS4;11/IRMI-2，MDA-MB-231 和 MDA-MB-468) 生長方面的效率要低得多。在來那度胺與 MG-277 競爭實驗中，來那度胺降低了 MG-277 對上述細胞系的生長抑制。因此，MG-277 對野生型和突變型 p53 細胞生長抑制活性，需要與 cereblon 結(jié)合。 據(jù)此，作者推測，MG-277 實際上可能起的分子膠的作用，通過促進某些細胞生長相關(guān)蛋白 -E3 連接酶 (CRL4CRBN) 復(fù)合物募集，進行泛素化和隨后的蛋白酶體降解。
如果 MG-277 作為分子膠，真正的靶標(biāo)蛋白是什么？
通過對野生型 p53 細胞和攜帶突變的 p53 細胞蛋白質(zhì)組分析，MG-277 的靶標(biāo)蛋白為 GSPT1，且降解 GSPT1 的水平取決于其與 cereblon，蛋白酶體和 Cullin-RING E3 連接酶功能的結(jié)合。MG-277 捕獲了一些與相互作用有關(guān)的關(guān)鍵殘基 (cereblon 中 Phe150 和 Glu377)，這些殘基對于將 GSPT1 募集到 cereblon 中是至關(guān)重要的。
總而言之，MG-277 以不依賴 p53 和 MDM2，但以依賴 cereblon，CUL4 E3 泛素連接酶和蛋白酶體的方式，在癌細胞中快速誘導(dǎo) GSPT1 降解。MG-277 誘導(dǎo) GSPT1 降解是其細胞生長抑制活性的原因。
而設(shè)計的鄰苯二甲酰亞胺共軛降解物，既可以作為目的蛋白質(zhì)的真正降解劑，也可以作為將新底物蛋白募集到 CRL4CRBN 的分子膠，用于泛素化和隨后的降解。因此，在 PROTAC 降解劑的設(shè)計中需要考慮這兩種機制。
特異性降解 “核蛋白” 的分子膠
接著，我們來講講另外一種新型“分子膠”。Benjamin Cravatt 團隊找到了新的 E3 連接酶成員 DCAF16，一種目前沒有文獻報道過相關(guān)功能的多肽 (在哺乳動物中高度保守，但嚙齒動物卻不存在的多肽)，此類 “分子膠” 以共價修飾 DCAF16 的方式，特異性促進核蛋白降解。
DCAF16 連接酶的發(fā)現(xiàn)
Benjamin Cravatt 團隊在之前的工作中鑒定出一些與半胱氨酸結(jié)合共價片段，作者稱為 “**” 片段 (Scoutfragment)。它們能 “搜尋” 出人類蛋白組中可配體的半胱氨酸，包括一些從未被研究的泛素化連接酶。作者將 KB02、KB03、KB05 三個“**”片段連接在 FKBP12 高親和性的配體 SLF 上。發(fā)現(xiàn) KB02-SLF、KB03-SLF、KB05-SLF 均未改變胞質(zhì)蛋白 FKBP12 水平。其中，KB02-SLF 顯著降低核蛋白 FKBP12 的水平。
DCAF16 在誘導(dǎo)核蛋白降解的過程中是如何被修飾的？
串聯(lián)質(zhì)譜 (MS/MS) 分析和定點誘變實驗表明，KB02-SLF 是修飾了 DCAF16 的 Cys177-179 三個半胱氨酸位點。其中 DCAF16 中的 C177 和 C179 為極有可能是介導(dǎo) FKBP12 降解的關(guān)鍵的位點。接下來，作者構(gòu)建的 KB02-JQ1 雙功能分子 (誘導(dǎo)核蛋白 BRD4 降解)，在敲除的 DCAF16 細胞中，KB02-JQ1 誘導(dǎo)的 BRD4 降解則被抑制。
相關(guān)產(chǎn)品
MG-277 是一種由 PROTAC 降解劑轉(zhuǎn)化而來的分子膠。MG-277 誘導(dǎo)中等程度的 MDM2 降解。MG-277 以非 p53 的方式高度有效地抑制腫瘤細胞的生長，對 RS4;11 細胞和 p53 突變體 RS4;11/IRMI-2 細胞的 IC50 分別為 3.5 nM 和 3.4 nM。MG-277 有效的誘導(dǎo)翻譯終止因子 GSPT1 的降解，DC50 為 1.3 nM。MG-277 具有有效的抗癌活性。 KB02-SLF 是一種核 FKBP12 降解劑 (molecular glue)。KB02-SLF 通過共價修飾 DCAF16 (E3 ligase) 促進 FKBP12 降解，并可以提高生物系統(tǒng)中蛋白質(zhì)降解的持久性。KB02-SLF 由 SLF 與泛素 E3 連接酶配體 (KB02) 通過 linker 連接而成。KB02-JQ1
KB02-JQ1 是一種高選擇性 BRD4 降解劑 (molecular glue)。KB02-JQ1 通過共價修飾 DCAF16 (E3 ligase) 促進 BRD4 降解，并可以提高生物系統(tǒng)中蛋白質(zhì)降解的持久性。KB02-JQ1 由 JQ1 與泛素E3 連接酶配體 (KB02) 通過 linker 連接而成。 Pevonedistat (MLN4924) 是一種有效，選擇性的 NEDD8 活化酶 (NAE) 抑制劑，IC50 為 4.7 nM。NEDD8 活化酶參與 CRL 激活的第一步，通過激活 NEDD8 并隨后轉(zhuǎn)移到 Ubc12，NEDD8 途徑的 E2 結(jié)合酶。
參考文獻
[1] Yang J, et al. Simple StructuralModifications Converting a Bonafide MDM2 PROTAC Degrader into a Molecular GlueMolecule: A Cautionary Tale in the Design of PROTAC Degraders. J Med Chem. 2019 Oct 21.[2] Cromm PM, et al. Targeted Protein Degradation: from Chemical Biology to Drug Discovery. Cell Chem Biol. 2017 Sep 21;24(9):1181-1190.
[3] Lu G, et al.The myeloma drug lenalidomide promotes the cereblon-dependent destruction of Ikaros proteins. Science. 2014 Jan 17;343(6168):305-9.
[4] Lopez-Girona A, et al. Cereblon is a direct protein target for immunomodulatory and antiproliferative activities of lenalidomide and pomalidomide. Leukemia. 2012 Nov;26(11):2326-35.
[5] Hughes S J, et al. Molecular recognition of ternary complexes: a new dimension in the structure-guided design of chemical degraders. Essays Biochem. 2017 Nov 8;61(5):505-516.
[6] Keriann M.Backus, et al. Proteome-wide covalent ligand discovery innative biological systems.Nature. 2016 Jun23;534(7608):570-4.
[7] Bar-Peled L, et al. Chemical Proteomics Identifies Druggable Vulnerabilities in a Genetically Defined Cancer.Cell. 2017 Oct 19;171(3):696-709.e23.
[8] Zhang X, et al. Electrophilic PROTACs that degrade nuclear proteins by engaging DCAF16. Nat Chem Biol. 2019 Jul;15(7):737-746.
