【前情回顧】PCR疑難問題粉碎機（一）——終點PCR

     【前情回顧】PCR疑難問題粉碎機（二）——熒光定量PCR

 

       逆轉(zhuǎn)錄 PCR（Reverse TranscriptionPCR, RT-PCR）是一種以 RNA 為樣本，RNA鏈被逆轉(zhuǎn)錄成為互補 DNA（cDNA），再以此為模板通過 PCR 進行 DNA 擴增。在實際應用中，RT-PCR 分為一步法 RT-PCR 和兩步法 RT-PCR。整個反轉(zhuǎn)錄實驗過程有三個重要的因素，分別是RNA模板、反轉(zhuǎn)錄時所使用的引物類型、反轉(zhuǎn)錄酶 。

 

       RNA模板

 

       高質(zhì)量的 RNA 基本有幾個參數(shù)可供參考，首先是 OD260/280 以及 OD260/230的值應該都是 2.0 左右，如果 OD260/280 小于 1.9，說明 RNA 中有一些蛋白質(zhì)的殘留，如果這個值大于 2.1，則很可能樣本中 RNA 有一定的降解。OD260/230如果小于 2.0，說明 RNA 中含有異硫氰酸胍，酚殘留，而這些物質(zhì)對逆轉(zhuǎn)錄反應影響是非常大的。另外就是瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA 的完整性，正常的 RNA一般呈現(xiàn)三條帶，即 5s、18s、28s，其各自的亮度呈現(xiàn)遞增狀態(tài)，依據(jù)物種不同可逆轉(zhuǎn)錄 PCR能存在些許差異。當 RNA 出現(xiàn)降解時，反饋最明顯的是 5s rRNA 的亮度顯著提高。下圖展示的分別是高質(zhì)量 RNA、稍有降解以及完全降解的實例：

 

       反轉(zhuǎn)錄引物

 

       提取到了高質(zhì)量的 RNA模板后，下一個需要考慮的問題便是引物的選擇了。通常，反轉(zhuǎn)錄引物有三類，分別是 oligodT、隨機引物和序列特異性引物：oligodT引物能特異性結(jié)合在含有 polyA 尾的 mRNA 末端起始反轉(zhuǎn)錄反應，但這一特性決定了它只能擴增含有 polyA 尾的 mRNA，而且對 RNA 模板的質(zhì)量要求較高，一旦 polyA 尾發(fā)生降解，就不能被引物所識別，從而導致產(chǎn)物中沒有相應基因的cDNA；隨機引物一般含有 6-9 個隨機序列的堿基，能夠隨機識別結(jié)合在 RNA 模板上，因此這類引物的優(yōu)點在于能同所有類型的 RNA 結(jié)合，而且比較適合于含有二級結(jié)構(gòu)的 RNA 及微量樣本，具有較高的反轉(zhuǎn)錄靈敏度。

 

       但缺點在于，結(jié)合的隨機性會造成 cDNA小片段較多，有時候還會對微量目的片段造成稀釋；序列特異性引物，顧名思義，針對于特定的序列設計的反轉(zhuǎn)錄引物，用于特異性的反轉(zhuǎn)錄某一段序列。在實際的應用中，我們通常會研究同一個個體或細胞中不同基因表達水平的變化，因此序列特異性基因相對用的少一些。Solis BioDyn 可供的反轉(zhuǎn)錄預混液中可提供多種不同的引物（oligodT、隨機引物、以及 oligodT 與隨機引物的結(jié)合）供您選擇，滿足您的一切實驗需求！

 

 

       逆轉(zhuǎn)錄酶

 

       Solis BioDyn 可提供兩種逆轉(zhuǎn)錄酶：分別是 MMLV（RNase H+）和 SOLIScript（RNase H-）逆轉(zhuǎn)錄酶。RNase H，是一種核糖核酸內(nèi)切酶，可以特異性地水解DNA-RNA 雜合鏈中的 RNA，不能水解單鏈或雙鏈 DNA 或 RNA。

 

 

類型		貨號	名稱
逆轉(zhuǎn)錄酶		06-13-00050	FIREScript KIT RNase H+ 逆轉(zhuǎn)錄酶
		06-33-00050	SOLIScript KIT RNase H- 逆轉(zhuǎn)錄酶
cDNA第一鏈合成		06-17-00100	FIREScript RT cDNA syntesis MIX without primers cDNA合成預混液，無引物
		06-18-00100	FIREScript RT cDNA syntesis MIX with Oligo (dT) primer cDNA合成預混液，Oligo引物
		06-19-00100	FIREScript RT cDNA syntesis MIX with Random primers cDNA合成預混液，隨機引物
		06-20-00100	FIREScript RT cDNA syntesis MIX with Oligo (dT) and Random primers cDNA合成預混液，Oligo及隨機引物
miRNA(加尾法）		QP113	All-in-OneTM miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit 2.0 miRNA cDNA 合成試劑盒
		QP010	All-in-OneTM miRNA qPCR Kit miRNA qPCR檢測試劑盒
		QP115	All-in-OneTM miRNA qRT-PCR Detection Kit 2.0 miRNA qRT-PCR檢測試劑盒
一步法RT-qPCR	染料法	QP071	BlazeTaq One-Step SYBR Green RT-qPCR Kit （with ROX） RT-qPCR試劑盒,ROX
		QP081	BlazeTaq One-Step SYBR Green RT-qPCR Kit （without ROX） RT-qPCR試劑盒,無ROX
	探針法	QP076	BlazeTaq Probe One-Step RT-qPCR Kit （with ROX） RT-qPCR試劑盒,ROX
		QP086	BlazeTaq Probe One-Step RT-qPCR Kit （without ROX） RT-qPCR試劑盒,無ROX
		08-65-00250	SOLIScript 1-step CoV Kit RT-qPCR試劑盒
		08-59-00250	SOLIScript 1-step Multiplex Probe Kit (ROX) RT-qPCR試劑盒,ROX
		08-61-00250	SOLIScript 1-step Multiplex Probe Kit (Purple) RT-qPCR試劑盒,Purple
在線客服	雷雷		閃閃

 

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       作為一家具有尖端的技術(shù)實力、一流的經(jīng)營管理水平和完善的市場銷售體系的生物高科技企業(yè)，總部位于武漢光谷國家級高新技術(shù)開發(fā)區(qū)，服務面向全國。艾美捷科技是集進口試劑、實驗室耗材銷售、技術(shù)服務與合約開發(fā)為一體的專業(yè)化高科技公司，為用戶提供最前沿的專業(yè)資訊、完備的產(chǎn)品、整合的解決方案，及優(yōu)質(zhì)的物流服務。為了更好的服務客戶，公司組建了一支經(jīng)驗豐富的研發(fā)團隊-艾美捷生物技術(shù)中心，進入研發(fā)生產(chǎn)階段，將更優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品推薦給國內(nèi)生物領域的同仁們!

 

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       三點：

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       企業(yè)愿景：成為受人尊重、世界一流的生物醫(yī)學產(chǎn)品及服務供應商。

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