PCR替代技術，RPA全攻略之疑難解答
 

      重組酶聚合酶擴增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，被稱為是可以替代PCR的核酸檢測技術(由英國公司TwistDx Inc開發(fā))。以此為基礎的TwistAmp® 核酸擴增產品，能夠在15分鐘內進行常溫下的單分子核酸檢測。該技術對硬件設備的要求很低，特別適合用于體外診斷、獸醫(yī)、食品安全、生物安全、農業(yè)等領域。

RPA反應需要在怎樣的溫度下進行?

      標準TwistAmp®試劑盒的運行溫度在37°C - 42°C之間。溫度超過42°C會使酶的活性受到影響。RPA反應在低于37°C的條件下也能進行，不過TwistAmp®試劑盒已經針對反應速度進行了優(yōu)化，不一定支持超出范圍的溫度條件。為了獲得更好的效果，TwistDx公司推薦用戶在40°C下使用于逆轉錄試劑盒。

RPA反應能實現多重化么?

       可以。RPA技術支持在同一個管中同時進行多個擴增反應。不過，多重化的引物組合需要精心設計，以便每個引物都能同樣有效的工作。需要注意的是，RPA反應的引物總量(nmol)最好不要超標太多。如果在一個反應中使用兩個以上的擴增引物，就應該控制不同引物的量。另外，我們應當事先考慮好檢測多個擴增事件的探針、設備以及熒光團的兼容性。

RPA反應需要在特殊儀器上進行么?

      不需要。對TwistAmp®基礎試劑盒和nfo試劑盒而言，只要溫度能控制在37-42°C之間就行。進行實時監(jiān)控的體系(如TwistAmp® exo試劑盒)，需要能夠激發(fā)和檢測熒光團的恒溫裝置，比如酶標儀或實時檢測的熱循環(huán)儀。

RPA反應能對模板進行定量么?

      可以。擴增子達到可檢出水平的時間，依賴于反應起始時的模板量。初始模板的拷貝越多，擴增子就越快達到可檢出水平。不過，這種定量需要精心的實驗安排，確保對照反應是同時開始的。舉例來說，可以利用鎂離子的添加時間進行控制。因為鎂離子一旦進入體系，RPA反應就會開始。
此外，較慢的擴增過程有助于更精確的定量。我們可以通過調整反應條件或引物設計來減慢RPA的反應速度。

擴增產物能在瓊脂糖凝膠上分析么?

      可以，TwistAmp®基礎反應、TwistAmp®nfo和TwistAmp® fpg都可以通過跑膠進行終點分析。不過TwistAmp® exo不行，因為該系統里的外切核酸酶會消化擴增子。

擴增反應能進行熒光終點分析么?

      可以。這樣比較的是反應開始時的熒光和反應結束時的熒光，熒光增強意味著發(fā)生了擴增。

RPA支持生物素或熒光標記的寡核苷酸么?

      支持。在RPA反應中，連有生物素或熒光團的引物與未修飾的引物表現差不多。據悉還沒有發(fā)現任何差異。

能用插入性染料實時監(jiān)控RPA么?

可以。插入性染料可以在RPA反應中進行定量和監(jiān)控。不過，這種染料可以結合任何雙鏈DNA，會生成來自引物的假陽性信號。由于RPA擴增在常溫下進行，這種噪音會比PCR嚴重一些。此外，不推薦把插入性染料用于TwistAmp® exo體系，因為體系中的核酸外切酶會在反應過程中切割擴增產物。

RPA試劑能制成master-mix么?

      可以。在進行DNA檢測時，可以把重懸緩沖液、引物和探針混合在一起，重懸凍干的RPA pellets。然后將不同DNA加入反應體系，最后用MgAc起始反應。在進行引物篩選時，可以用重懸緩沖液、模板DNA、探針和一個引物制成master-mix，將其分裝到1.5 ml小管之后再分別加入不同的引物。注意：只有當兩個引物都存在時，才能重懸凍干的RPA pellets，否則重組過程就會有偏向性。

跑膠之前需要回收RPA產物么?

      需要。RPA反應中的物質會干擾瓊脂糖電泳，如果不進行產物回收，跑出來的帶會出現拖尾。

RPA反應的擴增子能保存么?

       TwistAmp® Basic或nfo的擴增產物可以保存，短期可以放在4°C，保存時間較長的話建議放在-20°C。

TwistAmp® exo (RT)的擴增產物不能保存。因為擴增停止后如果沒有及時失活，外切酶III會快速消化擴增子。

TwistAmp® 基礎反應的擴增子能進行TA克隆么?

      TwistAmp®基礎反應中的聚合酶沒有編輯功能，擴增子應該是可以用于TA克隆的。不過TwistDx公司還沒有針對這項應用進行過測試。

能直接用標記的探針和TwistAmp®基礎試劑盒進行側流層析檢測么?

      可以。你可以用兩個經過修飾的引物來進行側流層析檢測(LFD)。不過TwistDx公司推薦使用探針和TwistAmp® nfo 試劑盒。這是因為RPA跟PCR差不多，也傾向于形成引物二聚體。如果引物不完美，很容易發(fā)生交叉反應，生成假陽性結果。而TwistAmp® nfo體系能夠避免這個問題。

在用側流層析試紙進行檢測時需要稀釋RPA產物么?

      是的。RPA反應中的一些物質會干擾試紙上的抗體，如果不能充分稀釋就會出現非特異性結合和假陽性信號。

在TwistAmp® exo (RT)反應即將結束時熒光急劇增強，這正常么?

       是正常的。在TwistAmp® exo反應中，聚合酶和核酸外切酶III處于競爭關系。隨著反應的能量逐漸耗盡，核酸外切酶III開始占據優(yōu)勢，結果導致熒光信號出現劇增。

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