研究過蛋白的人都能深刻體會其復雜性和多功能性，為解決蛋白研究的困境，應運而生了一系列技術、方法、儀器等。質譜技術就是其中一個典型代表，常被用于幾個蛋白研究的重要方向：蛋白基礎功能探究（結構、相互作用核酸/蛋白/蛋白組、修飾功能等），蛋白鑒定（定位、機理等），蛋白定量等。

 

很多初入門者一般談“譜”色變，不僅因為機器技術門檻高，而且對于上機樣品的質量要求極高。質譜儀性能的迭代更新為我們提供了更高的精度、更快的速度、更多的鑒定效率，而建立成熟完善的樣品前處理方法才是最重要的環(huán)節(jié)。

 

依據蛋白樣本的來源種類，質譜樣品一般分為細胞、組織、體液（血清、血漿、腦脊液、尿液等）。

 

圖1. 基于質譜的定量蛋白組工作流程

 

以下為大家整理了質譜上機前蛋白樣品制備的幾個核心環(huán)節(jié)和解決方案👇。

 

1 蛋白提取

 

1. 細胞或組織樣品裂解

細胞裂解及高效地蛋白提取對于高質量的蛋白純化至關重要。以下提供針對細菌、哺乳動物、酵母和植物細胞的裂解方案，以取得較之傳統(tǒng)物理裂解法更高的蛋白得率，甚至可從細胞樣品中選擇性提取目的蛋白及總蛋白的、亞組分蛋白，以及線粒體、葉綠體、細胞核、高爾基體及溶酶體等重要的細胞器。這些產品可與大多數親和純化方法相兼容，并且可以最大程度的保留蛋白活性，以備下游分析之用。

 

表1. 重組蛋白提取相關產品👇

表2. 天然蛋白提取相關產品👇

 

蛋白抽提過程中為防止蛋白降解，及時對蛋白酶進行抑制是很有必要的，比如MSSAFE系列質譜專用蛋白酶/磷酸酶抑制劑混合物，成功避免了任何抑制劑成分帶來的對蛋白的修飾，且不含金屬螯合劑，與IMAC兼容。

 

2. 體液樣本預處理

體液樣本在biomarker的發(fā)現中有重要意義，雖然目前還沒有通過質譜篩選或鑒定的方法發(fā)現的biomarker，但科學家們正在嘗試改良低豐度蛋白的富集和鑒定效率。這就需要我們能高效地去除體液樣本中的高豐度蛋白，如Albumin，IgG，transferrin等。相比市面上只能去除2種、12種的高豐度蛋白試劑，Seppro系列可去除多達50多種的中高豐度蛋白，富集到占總蛋白1%的低豐度蛋白。除了人類體液樣本Seppro^® 還有試劑盒用于小鼠和大鼠樣品的處理，以及從植物樣品中去除二磷酸核酮糖羧化酶。
 

 

圖2.人血漿蛋白組中高豐度蛋白分布圖

 

表3. 高豐度蛋白去除相關產品👇

 

2 蛋白定量

 

蛋白質種類繁多且結構不均一，分子量相差也很大，功能各異。生物實驗室中蛋白定量以Bradford法（B6916 Bradford Reagent）、BCA法（71285 BCA Protein Assay Kit）、考馬斯亮藍染色法最為常用。

 

3 蛋白酶解

 

從蛋白到多肽的消化步驟對于酶的要求極高，蛋白質組級別的胰蛋白酶保障了出色的序列覆蓋度，同時消除了模糊的自溶性MALDI 峰。Trypsin Profile IGD kit 可實現從PAGE 直接到MALDI 的進行快速高效完善的消化過程。Protease Profiler 提供了4 種經驗證的蛋白酶，可代替胰蛋白酶，進行MS 前的蛋白質消化步驟。

 

表4. 質譜級蛋白酶解相關產品👇

 

4 蛋白標記

 

發(fā)現蛋白組學（Discovery proteomics）中既可以用label-free的方式，也可以用基于iTRAQ，TMT，SILAC等標記方法的分析。例如以下iTRAQ試劑。

 

表5. 推薦的iTRAQ試劑👇

 

5 肽段富集

 

對消化后或標記后的多肽進行有目的性富集，比如糖肽（高甘露糖型、雜糖、復合型糖基化肽）、磷酸化多肽、胍基化、泛素化蛋白，可以用于后續(xù)更有針對性的分析。

 

表6. 肽段富集相關產品👇

 

質譜儀一般懼怕樣品中含鹽，所以對肽段脫鹽非常有必要，但樣本珍貴，需要保證高回收率且快速高效進行分析物的吸附/洗脫，且后續(xù)能直接用與質譜、HPLC、毛細電泳分析。如以下Supel-Tips和ZipTip系列。

 

表7. 脫鹽相關產品👇

如果樣本體積較大需進行濃縮，則需要選擇對蛋白吸附損失最低、回收效率最高的材料，比如以下Amicon系列濃縮管、超濾管。

圖3. 濃縮、超濾及透析相關產品

 

6 上機鑒定

 

完成以上核心步驟后，還需要對儀器進行校準。儀器校準一直以來依賴廠家工程師，但低效和費時，所以找到靈活簡便的校準方法可大大提高效率。ProteoMass MALDI校準試劑盒是業(yè)界廣泛認可的高品質校準產品，專門為MALDI-MS 應用開發(fā)，經過嚴格測試，不含鹽和金屬離子，改善目的分子的電離效率，同時避免產生導致光譜模糊的加合物。

 

對于定量蛋白組學，很重要的一點是要選擇標準品。默克可為您提供通用蛋白質組學標準品和蛋白質組學差異動態(tài)范圍標準品作為質譜研究的參照標準品。這兩組標準品均包含相同的48種人類蛋白，分子量在6,000至83,000道爾頓之間。其中的每個組份蛋白都經過HPLC純化及AAA定量。

 

表8. 質譜校準和標準品相關產品👇

 

綜上，Mass spec中樣本制備是蛋白組學分析的最關鍵步驟，樣品抽提和制備的質量和可重復性直接顯著影響到下游質譜的分離和鑒定能力。

 

圖4. 基于樣品類型的樣本制備方法小結