逍鵬小課堂之細胞消化基礎(chǔ)問答

瀏覽次數(shù)：1894　發(fā)布日期：2019-12-16　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責任自負

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第二課

細胞培養(yǎng)實驗中不可或缺的除了培養(yǎng)基，胰酶也是非常重要的一個角色，雖然細胞培養(yǎng)試驗基本技術(shù)大同小異，每種細胞的培養(yǎng)條件各不相同，但是，在細胞傳代過程中都少不了這個步驟—胰酶消化。

細胞消化使用胰酶時需要了解哪些問題？

一、細胞培養(yǎng)過程中為什么要使用胰酶呢？胰酶的作用是什么？
胰酶是一種蛋白酶，酶切位點是肽鏈的Lys或Arg兩個殘基的羧基端肽鏈，通過在特定位置上降解蛋白，使細胞膜上與培養(yǎng)皿壁結(jié)合處蛋白降解，從而使兩者分離。這時，細胞由于自身內(nèi)部細胞骨架的張力以及培養(yǎng)液表面張力可成為球形。

圖1.胰酶酶切位點

二、使用胎牛血清培養(yǎng)細胞，在使用胰酶消化時發(fā)現(xiàn)血清可以終止此過程，這是何原因？

血清終止的原理其實是競爭抑制，就是用過量的牛血清中含有的蛋白和胰酶結(jié)合，使胰酶失去消化細胞蛋白的機會。

三、為什么使用了胰蛋白酶消化，細胞還是成團的，這可能是什么原因?qū)е碌模?/p>

① 消化時間不夠 ② 吹打力度不夠 ③ 胰酶消化液濃度不夠 ④ 細胞密度過高之后才消化傳代 ⑤ 胰酶存儲不當，或者使用了過期胰酶

四、胰酶分裝凍存時要注意什么？

胰酶分裝時盡量分裝成多瓶，并遵守3次左右用完和只裝2/3體積的原則。因為冷凍保存時體積會膨脹，多次使用同一瓶胰酶反復(fù)凍融會降低消化效果并增大污染的可能性。

五、怎么才能判斷胰酶消化完全？

注意：不是細胞全部成間隔分布很離散的單個圓形才表示消化好了。

一般肉眼觀察貼壁細胞層，只要能移動了，多半呈沙狀移動就可以了，就應(yīng)該停止消化。

六、胰酶適用于哪些細胞消化？它的消化效果與哪些有關(guān)呢？

胰酶適用于消化細胞間質(zhì)較少的軟組織和傳代細胞，如胚胎、上皮、肝、腎等組織，但對纖維性組織和較硬的癌組織效果較差。胰酶的消化效果主要與pH值、溫度、胰酶濃度、組織塊大小和硬度有關(guān)。

七、胰酶中的酚紅有哪些作用？

酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為pH指示劑，中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時為紫色。研究表明：酚紅可以模擬固醇類激素（特別是雌激素）的作用。為避免固醇類反應(yīng)，培養(yǎng)細胞尤其是哺乳類細胞時，建議用不含酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測，在做流式細胞檢測時，也會使用不含酚紅的培養(yǎng)基或者胰酶。

圖 2. Phenol red test

八、在做細胞凋亡檢測時，細胞為什么不能用含有EDTA的胰酶消化？

Annexin V（膜聯(lián)蛋白）是Ca2+依賴的蛋白，EDTA會螯合Ca2+從而影響Annexin V，進而影響結(jié)果，因此需選用不含EDTA的胰酶。建議放入培養(yǎng)箱中進行消化，時間可以長一點。隨時觀察細胞情況，避免消化過度；也可使用細胞刮刀將細胞刮下，后用槍吹勻，比消化簡單，還可避免使用胰酶帶來的傷害。

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