NTA可以用來

   外泌體定量嗎？

希爾博士的意見是：

NTA可以提供樣本中顆粒的粒徑分布和絕對(duì)濃度，但不能夠以NTA所提供的濃度數(shù)值這個(gè)單一的指標(biāo)來定量外泌體。

首先，我們必須理解NTA檢測(cè)原理：該技術(shù)基于布朗運(yùn)動(dòng)，通過視頻分析顆粒計(jì)數(shù)，可同時(shí)獲取樣本中顆粒的粒徑和絕對(duì)濃度。

因此，樣本中的所有顆粒，都會(huì)被偵測(cè)并計(jì)入，而不能篩選出外泌體單獨(dú)進(jìn)行計(jì)數(shù)；同理：也不能通過NTA所提供的粒徑分布情況這個(gè)單一的指標(biāo)判斷所提取出的內(nèi)容物就是外泌體；例如下圖為常見的粒徑濃度分布圖，可以說明所提取的內(nèi)容物是在外泌體粒徑范圍內(nèi)，但是否為外泌體還需要結(jié)合其他方法綜合驗(yàn)證，譬如：透射電鏡、western blot等。

某外泌體樣本的粒徑-濃度分布圖（檢測(cè)方法：NTA）
那到底怎樣可以定量外泌體呢？
我們來看一下國(guó)際胞外囊泡協(xié)會(huì)（ISEV)新發(fā)布的Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018（簡(jiǎn)稱MISEV 2018)是如何說的：

EVs have a particulate structure and contain proteins, lipids, nucleic acids, and other biomolecules. Quantification of each of these components can be used as a proxy for quantification of EVs, but none of these values is necessarily perfectly correlated with EV number.

這段話是說：EVs（extracellular vesicles）有其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和內(nèi)含物（蛋白、脂質(zhì)體、核酸和其他生物分子）。用其中任意一個(gè)指標(biāo)來定量EVs都是可以接受的，但也沒有任何一個(gè)值能確切反映EV的數(shù)量。

所以，目前沒有完美的外泌體定量方法。
當(dāng)然，正如MISEV2018所述，大家還是可以基于EVs獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和內(nèi)含物來進(jìn)行定量：

顆粒數(shù)

利用NTA、FCW、TRPS、SPR等都可以用于顆粒計(jì)數(shù)，不同平臺(tái)得到的數(shù)值會(huì)有差異。

當(dāng)然，以顆粒數(shù)來定量外泌體，通常都會(huì)高估，因?yàn)槿绻�外泌體樣本中存在脂蛋白、蛋白團(tuán)聚等，這些雜質(zhì)也會(huì)被一起計(jì)入。熒光模式下的NTA檢測(cè)可以實(shí)現(xiàn)檢測(cè)特定亞群的EVs，前提是對(duì)EVs的特殊表達(dá)蛋白進(jìn)行熒光標(biāo)記。

總蛋白量

可用比色法（Bradfold或BCA）、熒光法或直接在SDS-PAGE染色檢測(cè)總蛋白量。由于容易存在其他蛋白的污染，這個(gè)方法同樣容易高估囊泡數(shù)量。另外，是否使用detergent也會(huì)對(duì)結(jié)果有影響，因此如使用detergent，需要指明種類和使用濃度。

總脂質(zhì)量

此方法利用親脂性熒光染劑（譬如：DiR）等檢測(cè)，但需要考慮背景值里其他脂質(zhì)成分的干擾。

總RNA量

不是很推薦的方法，因?yàn)槿缬泻颂求w蛋白或脂蛋白也會(huì)影響檢測(cè)的數(shù)值。

EVs特殊標(biāo)記物定量

此方法基于特異性表達(dá)蛋白（例如：CD9、CD81或CD63等），使用ELISA、時(shí)間分辨熒光免疫分析法（TRIFic CD9/81/63 Exosome Assay， Cell Guidance Systems）、FCW或納米管比色法定量特定亞群的外泌體數(shù)量。

上述各方法都不完美，因此實(shí)際上，外泌體的研究過程中，經(jīng)常需要結(jié)合不同定量數(shù)據(jù)作為純度的參照，例如蛋白/顆粒比、蛋白/脂質(zhì)比或蛋白/RNA比等。