文章導(dǎo)讀
胰腺癌是一種惡性程度很高，診斷和治療都很困難的消化道惡性腫瘤，約90%為起源于腺管上皮的導(dǎo)管腺癌。其發(fā)病率和死亡率近年來(lái)明顯上升。5年生存率<1%，是預(yù)后最差的惡性腫瘤之一。m6A甲基化修飾是pri-miRNA加工和成熟的重要機(jī)制，但其異常調(diào)控在人類疾病中的作用尚不清楚。本研究作者發(fā)現(xiàn)，吸煙產(chǎn)生的香煙煙霧冷凝液（cigarette smoke condensate，CSC）能夠通過(guò)m6A修飾誘導(dǎo)miR-25-3p前體成熟，從而促進(jìn)胰腺癌的發(fā)生發(fā)展。

 

發(fā)表期刊：NATURE COMMUNICATIONS
影響因子：12.353
實(shí)驗(yàn)方法：miRNA測(cè)序、m6A pri-miRNA測(cè)序、ChIP qPCR、RNA pull down
實(shí)驗(yàn)材料：CSC（香煙煙霧冷凝液），DMSO（普通化學(xué)溶解劑），胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞，胰腺細(xì)胞等

1. CSC誘導(dǎo)PDAC細(xì)胞中致癌基因miR-25-3p過(guò)表達(dá)
CSC處理胰管上皮細(xì)胞和未處理組分別進(jìn)行miRNA測(cè)序（云序可提供此服務(wù)），篩選到實(shí)驗(yàn)組中差異高表達(dá)的miRNA----miR-25-3p。并且，miRNA的表達(dá)量對(duì)CSC濃度正相關(guān)。前面是細(xì)胞中的情況，接著作者檢測(cè)了抽煙和不抽煙人群胰腺組織中miRNAs的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miR-25-3p在吸煙者中也是高表達(dá)的。在正常和胰腺癌細(xì)胞中，也發(fā)現(xiàn)miR-25-3p在癌細(xì)胞中顯著上調(diào)。以上結(jié)果表明抽煙和PDAC疾病會(huì)導(dǎo)致miR-25-3p的表達(dá)量顯著上調(diào)。接著作者又結(jié)合臨床指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)miR-25-3p高表達(dá)的PDAC病人生存時(shí)間較短。同時(shí)，miR-25-3p與細(xì)胞增殖、遷移和侵襲表型相關(guān)。

圖1. CSC誘導(dǎo)miR-25-3p及其對(duì)PDAC患者存活時(shí)間的影響

那么問(wèn)題來(lái)了，CSC是如何導(dǎo)致吸煙者體內(nèi)miR-25-3p的高表達(dá)呢？

2.CSC促進(jìn)METTL3介導(dǎo)的pri-miR-25成熟
為進(jìn)一步闡明CSC誘導(dǎo)miR-25-3p的分子機(jī)制，作者首先檢測(cè)了CSC處理PDAC細(xì)胞時(shí)pri-miR-25、pre-miR-25和miR-25-3p的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)CSC處理能夠降低pri-miR-25表達(dá)同時(shí)增加pre-miR-25和miR-25-3p表達(dá)，暗示CSC可能通過(guò)調(diào)控pri-miR-25的加工和成熟來(lái)誘導(dǎo)miR-25-3p的高表達(dá)。由于m6A甲基化修飾在miRNA前體加工和成熟過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用，作者檢測(cè)了幾個(gè)重要的m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶，查看這些酶是否會(huì)影響CSC誘導(dǎo)的miR-25-3p的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CSC會(huì)誘導(dǎo)METTL3高表達(dá)且呈現(xiàn)濃度依賴性，但對(duì)METTL14和WTAP表達(dá)無(wú)影響。隨后，作者做進(jìn)一步驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在PDAC細(xì)胞中過(guò)表達(dá)METTL3酶，能夠顯著降低pri-miR-25水平，升高pre-miR-25和miR-25-3p水平，反之亦然。同時(shí)，敲減METTL3也顯著降低CSC誘導(dǎo)的miR-25-3p表達(dá)。以上數(shù)據(jù)暗示，CSC可能通過(guò)提高M(jìn)ETTL3的表達(dá)，進(jìn)而促使miR-25-3p高表達(dá)。

圖2.  CSC通過(guò)上調(diào)METTL3的表達(dá)促進(jìn)了pri-miR-25的成熟

那么問(wèn)題來(lái)了，CSC是如何提高M(jìn)ETTL3的表達(dá)呢？

3.CSC誘導(dǎo)METTL3啟動(dòng)子低甲基化并促進(jìn)其表達(dá)
首先，作者通過(guò)DNA甲基化低通量驗(yàn)證技術(shù)（云序可提供此服務(wù)），證實(shí)CSC能夠抑制MeTTL3基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化程度。通過(guò)ChIP-qPCR（云序可提供此服務(wù)）實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示CSC處理能夠降低DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶DNMT1和DNMT3a在METTL3啟動(dòng)子的結(jié)合。這種情況在吸煙者的胰腺組織中同樣存在。接著作者通過(guò)生信分析確定了調(diào)控METTL3的4個(gè)潛在轉(zhuǎn)錄因子，但在腫瘤和非腫瘤的胰腺組織中只有NFIC這個(gè)轉(zhuǎn)錄因子與METTL3的mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)。為進(jìn)一步驗(yàn)證，作者在PDAC細(xì)胞中敲減NFIC，發(fā)現(xiàn)METTL3和miR-25-3p的表達(dá)量顯著降低。此外，吸煙者的非腫瘤胰腺組織中NFIC在METTL3啟動(dòng)子的結(jié)合同樣顯著增加。以上結(jié)果表明，CSC通過(guò)降低METTL3啟動(dòng)子區(qū)域的DNA甲基化，使其與轉(zhuǎn)錄因子NFIC結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)METTTL3的表達(dá)。

 

圖3. CSC通過(guò)降低METTL3啟動(dòng)子區(qū)甲基化促進(jìn)其表達(dá)

4.METTL3通過(guò)調(diào)控m6A修飾介導(dǎo)pri-miR-25成熟
為進(jìn)一步探索了METTL3是否影響miR-25-3p成熟，作者首先通過(guò)m6Apri-miRNA甲基化測(cè)序（云序可提供此服務(wù)）分析了pri-miR-25上的m6A位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)m6A的確存在于pri-miR-25剪切位點(diǎn)。MeRIP-qPCR（云序可提供此服務(wù)）分析顯示，PDAC樣本中pri-miR-25的m6A修飾比非PDAC樣本要高很多。同樣的，CSC處理增加細(xì)胞中pri-miR-25的m6A修飾；而過(guò)表達(dá)METTL3同樣增加pri-miR-25的m6A修飾，敲減METTL3則相反。這些結(jié)果暗示METTL3在m6A的形成和miR-25-3p的成熟中發(fā)揮著重要作用。為檢測(cè)m6A是否直接調(diào)控miR-25成熟，作者利用體外轉(zhuǎn)錄的含m6A的pri-miR-25（[m6A]pri-miR-25）和不含m6A修飾的pri-miR-25進(jìn)行了體外RNA成熟實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，[m6A]pri-miR-25被剪切成的pre-miR-25顯著增加；當(dāng)pri-miR-25上METTL3結(jié)合區(qū)域發(fā)生突變后，pri-miR-25被剪切成的pre-miR-25顯著降低。這些體外結(jié)果與細(xì)胞內(nèi)相一致，提示吸煙者和PDAC病人中高表達(dá)的miR-25-3p可能是由于香煙刺激導(dǎo)致METTL3高表達(dá)，增加pri-miR-25上m6A修飾所致的。

圖4. METTL3通過(guò)調(diào)控m6A修飾促進(jìn)pri-miR-25成熟

5. NKAP為pri-miR-25中m6A的識(shí)別蛋白
為找到pri-miRNA的reader酶，作者通過(guò)RNA Pull Down（云序可提供此服務(wù)）聯(lián)合質(zhì)譜，找到22個(gè)與pri-miRNA m6A結(jié)合的蛋白。DGCR8是pri-miR-25加工成熟過(guò)程中重要的酶，做coIP（云序可提供此服務(wù)）后發(fā)現(xiàn)有9個(gè)蛋白與DGCR8相互作用。兩者取交集后發(fā)現(xiàn)NKAP，為pri-miR-25中m6A的識(shí)別蛋白。

 

圖5. NKAP是pri-miR-25中m6A的識(shí)別蛋白

6. miR-25-3p靶向PHLPP2激活A(yù)KT-p70S6K信號(hào)通路
接下來(lái)，作者研究了miRNA與其靶基因的作用機(jī)制，借助生信分析預(yù)測(cè)了miR-25-3p的潛在靶基因PHLPP2。通過(guò)熒光素酶和過(guò)表達(dá)以及敲除實(shí)驗(yàn)證實(shí)PHLPP2確實(shí)是miR-25-3p的潛在靶基因。最后，對(duì)文章進(jìn)行了升華，證實(shí)靶基因參與了AKT信號(hào)通路并影響p70S6K磷酸化水平。

 

圖6. 在PDAC中吸煙可通過(guò)miR-25-3p激活A(yù)KT-p70S6K信號(hào)

總結(jié)
在本研究中，作者首先通過(guò)miRNA高通量測(cè)序手段，在CSC處理組中篩到表達(dá)最高的miR-25-3p，并在臨床和功能上意義重大。
隨后，作者兵分兩路，深入挖掘miR-25-3p差異表達(dá)原因及其功能。
一方面：證實(shí)CSC誘導(dǎo)METTL3啟動(dòng)子低甲基化并通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子NFIC使其表達(dá)升高，從而增加pri-miR-25的m6A甲基化程度；一方面：找到了pri-miR-25的m6A甲基化識(shí)別蛋白為NKAP，通過(guò)與miRNA成熟加工蛋白DGCR8和Drosha形成復(fù)合體促進(jìn)pri-miR-25成熟為miR-25-3p；最后通過(guò)生信手段找到miR-25-3p的靶基因PHLPP2，證實(shí)其通過(guò)激活A(yù)KT癌癥信號(hào)通路促進(jìn)PDAC的發(fā)生和發(fā)展。

全文鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41467-019-09712-x
 

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