文章導(dǎo)讀：
“忽如一夜春風(fēng)來(lái)，千樹(shù)萬(wàn)樹(shù)梨花開(kāi)！”自然界的花花草草在悄無(wú)聲息的感受著大自然的變化。隨著全球氣候的變化，環(huán)境溫度也在不斷的變化，那么什么是溫度感受器？AET1是tRNA上鳥(niǎo)苷轉(zhuǎn)移酶，它是水稻高溫條件下正常生長(zhǎng)所必需的。本文研究結(jié)果表明，tRNAHis鳥(niǎo)苷轉(zhuǎn)移酶AET1在植物應(yīng)對(duì)高溫環(huán)境中發(fā)揮著重要作用。

發(fā)表期刊：MOLECULAR PLANT
影響因子：10.12
實(shí)驗(yàn)方法：tRNA測(cè)序、RIP、RIP qPCR、RNA pull down

1. AET1突變水稻熱敏性
AET1突變水稻在高溫環(huán)境下生長(zhǎng)時(shí)主要呈矮小株，葉片狹窄卷曲，無(wú)法產(chǎn)生種子，相反在相對(duì)溫和環(huán)境下生長(zhǎng)時(shí)沒(méi)有展現(xiàn)其他異常性狀。AET1基因的ORF區(qū)第1144個(gè)SNP（C突變?yōu)門(mén)）會(huì)引起第382個(gè)氨基酸從脯氨酸改變?yōu)榻z氨酸。預(yù)測(cè)AET1基因編碼tRNA鳥(niǎo)苷轉(zhuǎn)移酶，多物種比對(duì)結(jié)果顯示AET1基因在包含哺乳動(dòng)物在內(nèi)的多種真核生物當(dāng)中都是高度保守的，而第382個(gè)氨基酸在大部分雙子葉和單子葉植物中也是高度保守的。遺傳互補(bǔ)分析（genetic complementation test）顯示互補(bǔ)品系以及過(guò)表達(dá)水稻株都能夠有效的逆轉(zhuǎn)高溫下AET1突變所造成的異常形狀。CRISPR/Cas9的基因編輯水稻株也可以造成明顯的生長(zhǎng)缺陷�？刂谱兞繉�(shí)驗(yàn)表明溫度是造成這一現(xiàn)象的環(huán)境因素，并且AET1基因是水稻對(duì)非生物因素敏感的主要原因。進(jìn)一步觀察可以看到的是，盡管野生型和AET1突變水稻幼苗們沒(méi)有明顯的形態(tài)學(xué)改變，但是超微結(jié)構(gòu)已經(jīng)有巨大的改變，表明AET1基因?qū)τ诟邷貤l件下細(xì)胞的增值是必不可少的。所有的形態(tài)學(xué)觀察和表型實(shí)驗(yàn)都說(shuō)明AET1在水稻的生長(zhǎng)、發(fā)育過(guò)程中對(duì)高溫的應(yīng)答過(guò)程種起到重要作用。

圖1. AET1突變體是熱敏性的

2.AET1對(duì)tRNAHis成熟和tRNA表達(dá)穩(wěn)態(tài)起重要作用
體外酶活實(shí)驗(yàn)證明AET1編碼的AET1His可以結(jié)合到pre-tRNA（tRNAHis前體）并在pre-tRNAHis 5’端添加鳥(niǎo)嘌呤，然而發(fā)生了突變的AET1P382S沒(méi)有該功能，表明被突變的382位的脯氨酸對(duì)于tRNA的鳥(niǎo)嘌呤轉(zhuǎn)移酶活性是必不可少的。tRNA測(cè)序（云序生物提供）結(jié)果表明，野生型和AET1突變型水稻株在正常和高溫條件下成熟tRNA的表達(dá)水平改變。測(cè)序結(jié)果表明，正常溫度下AET1突變體和野生型當(dāng)中的tRNA異形體（isotype）含量相差不大，但是在高溫條件下AET1突變體當(dāng)中的含量要明顯的高于野生型水稻株，并且高溫條件下頭部5’帶有鳥(niǎo)嘌呤的tRNA在AET1突變體當(dāng)中有明顯的下降，這些現(xiàn)象都說(shuō)明常溫下，AET1基因的酶活性在AET1突變體當(dāng)中沒(méi)有太大改變，但高溫下酶功能會(huì)明顯喪失。tRNA測(cè)序分析可以看到其他類(lèi)型的tRNA，比如tRNAMet，在AET1突變株當(dāng)中的tRNAMet有明顯減少，由于tRNAMet和蛋白的翻譯效率相關(guān)，所以推測(cè)在高溫條件下AET1敲除水稻株的發(fā)育缺陷很有可能是因?yàn)榈鞍追�譯效率低下造成。AET1基因?qū)τ趖RNA豐度的維持必不可少，AET1的突變足以改變tRNA表達(dá)譜，在高溫環(huán)境下，AET1介導(dǎo)的tRNA修飾可以改變多個(gè)和蛋白翻譯效率相關(guān)的tRNA的表達(dá)水平。

圖2. AET1突變?cè)隗w外消除了AET1的活性，并破壞了體內(nèi)tRNA表達(dá)譜

3.AET1、RACK1A、eIF3h在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的相互作用
酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)說(shuō)明兩個(gè)和核糖體相關(guān)的蛋白R(shí)ACK1A以及eIF3h都和AET1相互作用。RNA pull down（云序生物可提供）也證明了AET1與RACK1A以及eIF3h結(jié)合。通過(guò)GST標(biāo)簽的RACK1A蛋白也能夠富集MBP融合eIF3H。這些結(jié)果都能夠進(jìn)一步證明AET1、RACK1A以及eIF3h三個(gè)蛋白能相互結(jié)合。生物分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證明RACK1A、eIF3h以及AET1三者能持續(xù)相互作用，這些結(jié)果都證明三個(gè)蛋白在體內(nèi)能直接相互作用。融合蛋白的熒光信號(hào)顯示，蛋白的熒光信號(hào)和ER（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）標(biāo)志蛋白重疊，暗示三者之間的相互作用發(fā)生在內(nèi)置網(wǎng)上與核糖體相關(guān)。GUS染色，qRT-PCR分析AET1，RACK1A以及eIF3h三個(gè)基因的mRNA表達(dá)量，三個(gè)基因在所有的組織當(dāng)中具有廣泛表達(dá)，證明三個(gè)蛋白相互作用和廣泛的蛋白合成相關(guān)。

    

圖3. AET1與ER中RACK1A和eIF3h相互作用

4.AET1而不是RACK1A以及eIF3h直接和OsARF mRNA結(jié)合
AET1與RACK1A以及eIF3h的結(jié)合是否和mRNA相關(guān)？RIP測(cè)序（云序生物提供）幫助研究者快速的明確哪些mRNA能夠和蛋白AET1結(jié)合，分析結(jié)果顯示高溫條件下545個(gè)mRNA分子只在野生型水稻株當(dāng)中和AET1結(jié)合，而僅僅208個(gè)mRNA分子只在AET1突變植物當(dāng)中和AET1蛋白結(jié)合，50個(gè)基因的mRNA分子在兩個(gè)樣本當(dāng)中均發(fā)生結(jié)合。KEGG結(jié)果顯示高溫條件下野生型水稻株當(dāng)中和AET1結(jié)合的mRNA的來(lái)源基因往往和光合作用以及代謝過(guò)程相關(guān)，而高溫條件下只在AET1突變株當(dāng)中結(jié)合的mRNA往往和氨基酸代謝通路相關(guān)。這些結(jié)果均顯示AET1的功能喪失可以通過(guò)tRNA的表達(dá)分布的失衡從而影響蛋白的合成。比較有趣的是，熱圖提示高溫條件下和植物生長(zhǎng)素（auxin）相關(guān)的基因在野生型和突變型當(dāng)中有明顯的改變，OsARF基因發(fā)生了明顯富集，暗示AET1基因可能是通過(guò)改變植物生長(zhǎng)素信號(hào)通路來(lái)應(yīng)對(duì)高溫產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)。
對(duì)RIP-seq結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，RIP qPCR（云序生物可提供）結(jié)果顯示OsARF19基因的上游開(kāi)放閱讀框（uORF）和下游主要開(kāi)放閱讀框（mORF）被明顯富集，高溫條件下的野生型和AET1突變型這兩者的富集程度有所區(qū)別。之前的報(bào)道顯示擬南芥當(dāng)中，許多OsARF mRNA包含可以依賴(lài)eIF3h而抑制翻譯的uORFs，作者推測(cè)在OsARFs基因當(dāng)中的uORFs對(duì)mORFs的抑制作用也存在，通過(guò)預(yù)測(cè)，RIP-qPCR的進(jìn)一步驗(yàn)證表明OsARF23 mRNA含有獨(dú)特的“start-stop”uORF結(jié)構(gòu)，AET1能夠在高溫環(huán)境下通過(guò)OsARF mRNA來(lái)調(diào)控auxin信號(hào)通路。最終結(jié)果證明，是AET1，而不是RACK1A或者eIF3h廣泛的結(jié)合OsARF mRNA來(lái)調(diào)控OsARF mRNA的翻譯過(guò)程。

圖4. AET1與生長(zhǎng)素響應(yīng)因子的mRNA結(jié)合

5.AET1和RACK1A以及eIF3h共同調(diào)控OsARF mRNA的翻譯效率
高溫條件下OsARF19和OsARF23翻譯效率均下降，通過(guò)CRISPR/Cas9對(duì)RACK1A eIF3h基因進(jìn)行突變發(fā)現(xiàn)，相關(guān)基因有明顯下降，植物的生長(zhǎng)出現(xiàn)明顯的缺陷，比如高度下降、種子產(chǎn)率低等等問(wèn)題。AET1、eIF3h、RACK1A蛋白表達(dá)水平和mRNA轉(zhuǎn)錄水平保持一致，結(jié)果表明AET1蛋白可以明顯的降低OsARF23蛋白的翻譯效率，同時(shí)RACK1A以及eIF3h的敲除均能夠引起OsARF23的表達(dá)下降。AET1突變水稻株對(duì)于外源性的auxin并不敏感，并且AET1基因使水稻對(duì)于高溫有更好的適應(yīng)能力。

   

圖5. AET1與RACK1A和eIF3h一起調(diào)節(jié)OsARF mRNA的翻譯效率

總結(jié)：
植物是無(wú)梗生物，因此進(jìn)化出許多適應(yīng)環(huán)境溫度變化的策略。在本研究中，作者發(fā)現(xiàn)了一種名為AET1的鳥(niǎo)苷酰轉(zhuǎn)移酶，它可以結(jié)合ER(內(nèi)質(zhì)網(wǎng))中的RACK1A和elF3h蛋白，并與OsARF mRNAs緊密結(jié)合，從而調(diào)控相應(yīng)的蛋白的翻譯，使水稻對(duì)于高溫有更好的適應(yīng)能力。
 
全文鏈接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1674205219301625
 

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