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                                                              English | 中文版 | 手機(jī)版 企業(yè)登錄 | 個人登錄 | 郵件訂閱
                                                              當(dāng)前位置 > 首頁 > 技術(shù)文章 > 知識分享:穩(wěn)轉(zhuǎn)株的制備

                                                              知識分享:穩(wěn)轉(zhuǎn)株的制備

                                                              瀏覽次數(shù):3672 發(fā)布日期:2018-7-6  來源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責(zé)任自負(fù)

                                                              實(shí)驗(yàn)原理:

                                                              利用哺乳動物系統(tǒng)生產(chǎn)蛋白的方式有兩種:瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選。通過穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。針對瞬時轉(zhuǎn)染,外源基因在短時間轉(zhuǎn)錄翻譯得到的蛋白量較少,能夠滿足小量蛋白制備,大量生產(chǎn)成本很高。相對于此,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的是將外源基因整合到細(xì)胞自身的基因組上,隨著細(xì)胞的生長分裂外源基因可以穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá),同時經(jīng)過抗生素加壓篩選,最終得到能夠穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá)蛋白的細(xì)胞株,穩(wěn)轉(zhuǎn)株生產(chǎn)蛋白穩(wěn)定性更好,批次差異性更小。

                                                              穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的應(yīng)用

                                                              穩(wěn)定轉(zhuǎn)染適用原因

                                                              穩(wěn)定轉(zhuǎn)染應(yīng)用

                                                              外源基因要整合到細(xì)胞染色體上

                                                              基因敲除以及基因插入突變篩選等修飾基因組的研究

                                                              細(xì)胞之間存在個體差異,同一類型細(xì)胞,不同個體細(xì)胞 基因組存在差異,會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成干擾

                                                              單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選

                                                              外源基因未整合到細(xì)胞會導(dǎo)致注射入動物體內(nèi)后,外源 基因片段很快丟失

                                                              需要在動物體體內(nèi)注射已經(jīng)表達(dá)外源基因的細(xì)胞

                                                              一些蛋白穩(wěn)定性很強(qiáng),瞬時 RNA 干擾作用周期短,無法去除已經(jīng)表達(dá)的目的蛋白

                                                              需要通過穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選,實(shí)現(xiàn)更好的基因干擾效果

                                                              穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選很大程度上降低頻繁轉(zhuǎn)染或者病毒包裝的 成本,也很大程度上方便實(shí)驗(yàn)研究

                                                              在某些細(xì)胞中長期研究基因的功能

                                                              通過穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選,能使那些病毒載體也無法達(dá)到高轉(zhuǎn)導(dǎo) 效率的細(xì)胞高效表達(dá)外源片段

                                                              獲得外源片段的高效表達(dá)

                                                              避免引入人為因素影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精確性,穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選 有助于篩選出拷貝數(shù)適量的細(xì)胞

                                                              得到過表達(dá)的目的基因或干擾拷貝數(shù)

                                                              影響穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的因素

                                                              1、外源基因整合的幾率

                                                              決定了穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選的簡易程度,有利于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的獲得;

                                                              2、插入外源基因片段的拷貝數(shù)

                                                              一般情況下,低拷貝或者單拷貝可以降低人為因素的干擾;

                                                              3、整合位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄活躍度

                                                              整合位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄活躍度決定了穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選細(xì)胞后穩(wěn)轉(zhuǎn)株中外源基因片段的表達(dá)質(zhì)量;

                                                              4、外源基因片段整合到細(xì)胞后的穩(wěn)定性

                                                              不同的整合位點(diǎn)決定了外源片段在染色體中的穩(wěn)定性,有些區(qū)域易發(fā)生重組或者丟失,從而使穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選后出現(xiàn)丟失的現(xiàn)象。

                                                              制備穩(wěn)轉(zhuǎn)株的實(shí)驗(yàn)步驟

                                                              一.準(zhǔn)備及預(yù)實(shí)驗(yàn)

                                                              1、確定細(xì)胞系相關(guān)信息:需包括如下內(nèi)容

                                                              細(xì)胞系名稱

                                                              細(xì)胞培養(yǎng)條件

                                                              細(xì)胞增殖速度

                                                              支原體污染情況

                                                              注:務(wù)必保證細(xì)胞無支原體污染,方可進(jìn)行穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建!

                                                              2、查閱慢病毒感染該細(xì)胞的MOI值

                                                              3、預(yù)實(shí)驗(yàn)確定篩選藥物用量:

                                                              (1)查閱Puromycin/Blastincidin在目的細(xì)胞中穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選的致死用量信息;參考查閱得到的數(shù)據(jù),確定3個藥物濃度梯度(如沒有相關(guān)信息,則需將藥物濃度梯度范圍增大,數(shù)量增多至6個);

                                                              (2)D0將細(xì)胞鋪于6孔板中,使D1細(xì)胞融合度約90%;D1按(1)中設(shè)置的藥物梯度,加入藥物;

                                                              (3)D4換液,并重新加入藥物;

                                                              (4)D7觀察,找到致死率100%的孔,該孔使用的藥物濃度,即為藥物篩選濃度。

                                                              二.穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選及構(gòu)建

                                                              注:以下實(shí)驗(yàn)參數(shù),按1株穩(wěn)轉(zhuǎn)株為例描述,實(shí)驗(yàn)需考慮有無對照穩(wěn)轉(zhuǎn)株!

                                                              1、細(xì)胞鋪板:D0將細(xì)胞接種于6孔板中(4個孔),使D1細(xì)胞融合度約70%

                                                              病毒感染:

                                                              2、慢病毒上清:分別棄去6孔板中3個孔的0.5毫升培養(yǎng)基、1毫升培養(yǎng)基、2毫升培養(yǎng)基和,分別加入2毫升慢病毒上清、1.5毫升慢病毒上清和0.5毫升慢病毒上清;

                                                              3、純化慢病毒:選3個孔,并可按推薦MOI、大于此MOI及小于此MOI,共三個MOI值,添加慢病毒;

                                                              4、觀察感染效率:感染后72小時,觀察感染效率,效率高于80%最佳,最低不應(yīng)低于40%,選擇1-2個感染效率較好的孔。

                                                              5、篩選:

                                                              (1)多克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株:從感染72小時后開始于6孔板中加篩選藥物,每隔2天,重新?lián)Q液加入藥物。藥物篩選需至少持續(xù)14天,直至顯微鏡下觀察熒光細(xì)胞比例為100%。

                                                              注:第一次加入藥物時在上午進(jìn)行,4-6小時后觀察細(xì)胞狀態(tài),如細(xì)胞死亡過多,需更換新鮮不含藥物的培養(yǎng)基。

                                                              (2)單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株:建立在獲得多克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株基礎(chǔ)上。

                                                              A、有限稀釋法:

                                                              a.取24個1.5毫升EP管,每管中加入800毫升完全培養(yǎng)基;

                                                              b.用胰酶將多克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株消化(90%融合度,10毫升培養(yǎng)基終止消化),取80微升至第一個EP管中,混合均勻;

                                                              注:應(yīng)使用1000微升槍尖,混合時不要過度吸打,以免破壞細(xì)胞。

                                                              c.從第一個EP管中取80微升至第二個EP管中,混合均勻,以此類推。

                                                              d.將EP管中的細(xì)胞懸液,以每孔100微升,接種于96孔板中;

                                                              e.過夜培養(yǎng)后,觀察第12-24列,尋找只含有1個細(xì)胞的孔,并做好標(biāo)記;

                                                              f.培養(yǎng)3-4周,待標(biāo)記孔中細(xì)胞擴(kuò)增后,消化傳代擴(kuò)增,即為單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞。

                                                              注:培養(yǎng)的第一周不要換液,接下來每3-4天換液。

                                                              B、平板挑取法

                                                              a.計(jì)數(shù)100個多克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞,接種于一個10cm培養(yǎng)盤中;

                                                              注:盡量吹打均勻,防止細(xì)胞聚團(tuán)。

                                                              b.過夜培養(yǎng)后,觀察并尋找單個細(xì)胞的位置,并在盤底做標(biāo)記;

                                                              c.培養(yǎng)2周;

                                                              注:培養(yǎng)的第一周不要換液,接下來每3-4天換液。

                                                              d.待標(biāo)記處的細(xì)胞擴(kuò)增為肉眼可見的白點(diǎn),使用10微升移液器,調(diào)至最大量程,在尖端吸取一點(diǎn)胰酶(約5微升,且尖端為空氣),緩慢滴至白點(diǎn)處,保持槍尖靜置在白點(diǎn)上,且不讓胰酶留出白點(diǎn)所在范圍,1min后,迅速吹打,將消化下的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至96孔板中,傳代擴(kuò)增,即為單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞。約需2-3周。

                                                              注:每盤選取20個為宜,在消化時,需按照先消化邊緣的,再消化中心的原則,防止克隆之前的相互污染。培養(yǎng)的第一周不要換液,接下來每3-4天換液。

                                                               

                                                              備注:維真生物公司致力于為廣大科研工作者提供優(yōu)質(zhì)的病毒包裝服務(wù),服務(wù)項(xiàng)目包括:科研級和臨床級腺病毒、慢病毒、腺相關(guān)病毒(AAV)的包裝、質(zhì)粒載體構(gòu)建、TALEN 基因敲除、基因突變等。目前為止公司已經(jīng)擁有人源現(xiàn)貨質(zhì)粒庫(18 000個)、腺病毒現(xiàn)貨庫(12 000個)、腺相關(guān)病毒(AAV)現(xiàn)貨庫,公司還擁有豐富的定制服務(wù)項(xiàng)目。真誠歡迎您咨詢與選購!

                                                              發(fā)布者:山東維真生物科技有限公司
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