當前位置 > 首頁 > 技術文章 > 20分文章中的RNA甲基化，熱度與實力并存

20分文章中的RNA甲基化，熱度與實力并存

瀏覽次數(shù)：3800　發(fā)布日期：2018-3-9　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責任自負

近期華人科學家辛辛那提大學陳建軍教授研究了METTL14和m6A RNA甲基化修飾在正常和惡性造血過程中的重要作用，表明SPI1-METTL14-MYB/MYC信號軸在髓系分化以及白血病發(fā)生過程中的作用。該研究于2018年1月發(fā)表在干細胞頂級期刊《Cell Steam Cell》（影響因子：23.394）。

研究背景：

每一年，“Nature Methods”都會對過去一年中推動生物學發(fā)展的技術方法做出總結，并評選出當年影響力最大的技術。2016年，表觀轉(zhuǎn)錄組分析（Epitranscriptome analysis）榮膺Nature Methods年度生命科學技術。Epitranscriptome廣義的指添加到核糖核苷酸上的一切修飾，并引起機體相關表型變化的現(xiàn)象。其中，RNA甲基化研究是表觀轉(zhuǎn)錄組學一面大旗，在世界引起了新的科研熱潮。N6-甲基腺苷（m6A）是真核細胞信使RNA（messenger RNAs，mRNA）最常見的內(nèi)部修飾方式。許多證據(jù)表明mRNA或者非編碼RNA上的m6A修飾影響RNA的命運以及功能，并且在組織發(fā)育，晝夜節(jié)律，DNA損傷應答，性別決定和腫瘤發(fā)生等生理過程中都發(fā)揮重要的作用。然而，它在正�；蛘邜盒栽煅^程中的功能依然不清楚，本文針對該方向展開系統(tǒng)的研究。

研究思路：

RNA甲基化修飾伴隨系統(tǒng)酶系協(xié)同作用，其中包括“Writer”-負責甲基轉(zhuǎn)移過程，“Eraser”-負責去甲基化過程，“Reader”-負責甲基化位點識別。RNA m6A甲基轉(zhuǎn)移酶以復合物形式存在，這個復合物由METTL3/METTL14異二聚體催化核心和一個調(diào)節(jié)亞基WTAP組成。 METTL3具有活化的甲基轉(zhuǎn)移酶結構域，能夠催化腺苷酸（A）為m6A，METTL14特異性促進METTL3識別RNA底物�？茖W家研究發(fā)現(xiàn)METTL14作為m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復合體的重要組成部分，在正常造血干/祖細胞以及攜帶有t（11q23），t（15；17）或者t（8；21）急性髓系白血病細胞中有較高的表達水平，并且它在髓系分化過程中表達下調(diào)。沉默METTL14能夠促進正常的HSPC和AML細胞終末髓系分化，并且能夠抑制AML細胞的存活/增殖。在機制上，METTL14通過m6A修飾調(diào)節(jié)其靶基因（如：MYB，MYC）發(fā)揮致癌作用，并在蛋白質(zhì)水平受SPI1的負調(diào)控。METTL14在AML疾病以及白血病干/起始細胞（leukemia stem / initiation cells， LSCs/LICs）的發(fā)展以及維持過程中必不可少�？傊撗芯拷沂玖薙PI1-METTL14-MYB / MYC信號軸在髓細胞和白血病中的作用，并強調(diào)了METTL14調(diào)控m6A修飾在正常和惡性造血中的關鍵作用。

研究一：METTL14在HSPC中高表達，隨正常髓細胞生成下調(diào)

作者首先檢測了不同小鼠骨髓細胞（BMCs）中m6A甲基轉(zhuǎn)移酶及去甲基化酶的表達量，發(fā)現(xiàn)c-Kit-型小鼠Mettl14及Fto表達量顯著性下調(diào)。同時，c-Kit-型小鼠mRNA修飾水平也存在顯著性下降現(xiàn)象。進一步檢測HSCs和祖細胞中的Mett14表達量，結果顯示Mettl14在HSCs和Lin-Sca-1 + c-kit+ （LSK）細胞中高水平表達。確定Mettl14在定型或分化的骨髓譜系細胞中表達呈現(xiàn)下調(diào)趨勢后，作者進行細胞表型相關實驗，驗證Mettl14細胞功能。通過Mettl14干擾等實驗，作者發(fā)現(xiàn)隨著Mettl14在髓細胞生成過程中下調(diào)表達，其敲低進一步顯著促進了HSPC向髓樣細胞的分化，這意味著METTL14在抑制正常骨髓生成中起重要作用。作者后續(xù)發(fā)現(xiàn)Mettl14在急性髓性白血病細胞（AMLs）中有同樣的表達模式。

圖示：Mettl14骨髓譜系細胞中差異表達，Mettl14敲降抑制骨髓生成過程

研究二：METTL14表達受SPI1負調(diào)控

在了解METTL14在骨髓生成過程中特異表達后，作者研究了其表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。通過ChIP-Seq數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)造血調(diào)控因子，CEBPB, GABPA, ELF1, CEBPA以及 SPI1與METTL14上游啟動子區(qū)域具有結合位點。其中除SPI1是負調(diào)控外，其它因子都呈現(xiàn)正調(diào)控作用。敲除SPI1后，無論AMLs或CD34+ HSPCs中METTL14 mRNA及蛋白質(zhì)表達水平均上調(diào)。通過ChIP-qPCR驗證SPI1與METTL14 啟動子區(qū)有6個結合位點。上述實驗結果證實，SPI1是METTL14負反饋調(diào)節(jié)因子。

圖示：AMLs及CD34+ HSPCs中，SPI1對METTL14負調(diào)節(jié)作用

研究三：RNA-Seq結合m6A-Seq

尋找METTL14生理底物作者結合RNA-Seq以及m6A-Seq在MM6及NB4細胞（不同AMLs）中尋找METTL14生理底物。RNA-seq顯示在兩個細胞系中，METTL14敲低時560個基因顯著下調(diào)，而377個基因顯著上調(diào)（p <0.05;倍數(shù)變化> 1.2）�；蚣患治觯℅SEA）顯示相對于對照細胞，造血/白血病干細胞中下調(diào)的基因主要富集MYB下調(diào)靶基因。MM6和NB4細胞m6A-seq結果中鑒定出16,675和18,831個m6A峰，其對應于8,246和9,632個轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。與前期研究一致，m6A峰常規(guī)Motif為GGAC序列，且甲基化峰主要位于基因啟動子區(qū)域。作者結合miCLIP證實，METTL14敲低時mRNA甲基化的變化主要由內(nèi)部m6A，而不是5'Cap m6Am導致。

圖示：RNA-Seq及m6A-Seq數(shù)據(jù)展示，METTL14直接作用MYB及MYC基因

研究四：MYB及MYC為METTL14靶基因

分析m6A-seq及m6A-qPCR結果，發(fā)現(xiàn)在METTL14敲低時，MYB和MYC的m6A修飾豐度顯著降低。CLIP實驗直接證實METTL14直接結合MYC及MYB轉(zhuǎn)錄本。并且METTL14敲除AML細胞系中，MYB及MYC的表達量顯著下調(diào)控。除人源細胞系，作者還發(fā)現(xiàn)Mettl14敲除小鼠C-Kit+ HSPC中MYB及MYC轉(zhuǎn)錄本上m6A修飾減少，并且兩種基因表達量均下降。熒光素酶報告實驗證實，METTL14主要通過調(diào)控MYB及MYC甲基化水平，進而調(diào)控二者的表達水平。