血液乙酰膽堿酯酶活性比色法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）

主要用途

血液乙酰膽堿酯酶活性比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)乙酰膽堿酯酶反應(yīng)系統(tǒng)中釋放出巰基膽堿，使用Ellman試劑后，產(chǎn)生黃色5-巰基-2-硝基苯甲酸產(chǎn)物，出現(xiàn)吸光峰值的變化，即采用比色法來(lái)測(cè)定血液樣品中酶活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種動(dòng)物和人體血液樣品（血漿、血清、紅細(xì)胞等）乙酰膽堿酯酶的活性檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。

 

技術(shù)背景

乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase；AchE；EC3.1.1.7），又稱為紅細(xì)胞膽堿酯酶（RBC cholinesterase），廣泛存在于真核生物，包括某些植物，尤其在腦組織、神經(jīng)肌肉連接處（neuromuscular junction）、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的膽堿能突觸（cholinergic synapses）和紅細(xì)胞膜上高度表達(dá)，催化主要的神經(jīng)傳導(dǎo)介質(zhì)乙酰膽堿的水解反應(yīng)，產(chǎn)生乙酸和膽堿，終止突觸傳導(dǎo)。其功能在于調(diào)節(jié)乙酰膽堿作用。神經(jīng)毒氣，例如有機(jī)磷沙林（Sarin），抑制乙酰膽堿酯酶活性，導(dǎo)致神經(jīng)肌肉癱瘓，最終發(fā)生窒息（asphyxiation）。血清乙酰膽堿酯酶濃度顯著降低與有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑中毒有關(guān)，因此血液檢測(cè)是環(huán)境污染的重要指標(biāo)�；�于人工合成底物碘化硫代乙酰膽堿（acetylthiocholine iodide）在乙酰膽堿酯酶的作用下，水解產(chǎn)生乙酸和硫代膽堿（thiocholine），與Ellman試劑5,5-二硫基-雙（2-硝基苯甲酸）[5,5’-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）；DTNB]反應(yīng)后，產(chǎn)生黃色的5-巰基-2-硝基苯甲酸（5-thio-2-nitrobenzoic acid；TNB），通過(guò)其吸收峰值的變化（412nm波長(zhǎng)），來(lái)定量分析乙酰膽堿酯酶的活性。乙酰膽堿酯酶反應(yīng)系統(tǒng)為：

    Acetylcholinesterase 

acetylthiocholine iodide        →      acetate  +  thiocholine

                             

DTNB  +  thiocholine  →   TNB +  choline-S-S-TNB

 

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A） 120毫升

裂解液（Reagent B）  10毫升

緩沖液（Reagent C）  40毫升

反應(yīng)液（Reagent D）   2毫升

底物液（Reagent E）        4毫升

陰性液（Reagent F）     2毫升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)      1份

 

保存方式

保存裂解液（Reagent B）、反應(yīng)液（Reagent D）和底物液（Reagent E）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；反應(yīng)液（Reagent D）和底物液（Reagent E）避免光照；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品制備

比色皿或96孔板：用于比色的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析

 

實(shí)驗(yàn)步驟

• 樣品準(zhǔn)備

選擇一：血漿樣品

• 準(zhǔn)備好肝素、ACD或EDTA等抗凝管
• 抽取1毫升血液，置于抗凝管里
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為700g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上層黃色液體到新的1.5毫升離心管――此為血漿成分（注意：避免觸碰白色液體層）
• 即刻置于冰槽里備用或放進(jìn)－70℃冰箱里保存
• （選擇步驟）移取10微升進(jìn)行蛋白定量測(cè)定 （注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）

 

選擇二：血清樣品

1． 準(zhǔn)備好不含抗凝劑的儲(chǔ)存管 

• 抽取1毫升血液，置于儲(chǔ)存管里
• 室溫下，靜置30分鐘，直至血液凝結(jié)
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘，速度為2000g（或5000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上層黃色液體到新的1.5毫升離心管――此為血清成分（注意：避免觸碰白色液體層）
• 即刻置于冰槽里備用或放進(jìn)－70℃冰箱里保存
• （選擇步驟）移取10微升進(jìn)行蛋白定量測(cè)定 （注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）

 

選擇三：紅細(xì)胞樣品

• 準(zhǔn)備好肝素、ACD或EDTA等抗凝管
• 抽取1毫升血液，置于抗凝管里
• 轉(zhuǎn)移到15毫升錐形離心管
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心30分鐘，速度為200g（或1000RPM，例如eppendorf 5815）
• 小心抽去上清液
• 加入2毫升清理液（Reagent A），混勻
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心7分鐘，速度為1200g（或2500RPM，例如eppendorf 5815）
• 小心抽去上清液
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟6至8二次
• 加入2毫升預(yù)冷的裂解液（Reagent B）
• 渦旋震蕩15秒
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心7分鐘，速度為1200g（或2500RPM，例如eppendorf 5815）
• 小心移取上清液到新的15毫升離心管
• 即刻置于冰槽里備用或放進(jìn)－70℃冰箱里保存
• （選擇步驟）移取10微升進(jìn)行蛋白定量測(cè)定 （注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）

 

• 測(cè)定準(zhǔn)備

 

• 開(kāi)啟并設(shè)定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長(zhǎng)412nm，間隔5分鐘，讀數(shù)3次（共15分鐘），并置零
• 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；反應(yīng)液（Reagent D）和底物液（Reagent E）避免光照

• 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度；底物液（Reagent E）50℃溫育溶解

 

• 樣品背景對(duì)照測(cè)定

 

• 移取750微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入100微升陰性液（Reagent F）
• 加入100微升底物液（Reagent E）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 在37℃溫度下孵育3分鐘
• 加入50微升待測(cè)樣品（100微克蛋白）（注意：樣品須清澈） 
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品背景對(duì)照（15分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)）

 

• 樣品測(cè)定

 

• 移取750微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入100微升反應(yīng)液（Reagent D）
• 加入100微升底物液（Reagent E）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 在37℃溫度下孵育3分鐘
• 加入50微升待測(cè)樣品（100微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品讀數(shù)（15分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)）

 

五、計(jì)算樣品活性

 

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 1（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數(shù)]÷[0.05（樣品容量；毫升）X 13.6（毫摩爾吸光系數(shù)）X 15（反應(yīng)時(shí)間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

 

單位＝微摩爾硫代膽堿/分鐘

 

酶標(biāo)儀測(cè)定

在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：樣品背景對(duì)照和待測(cè)樣品

• 分別移取190微升緩沖液（Reagent C）到96孔板里
• 加入25微升陰性液（Reagent F）到樣品背景對(duì)照孔里
• 加入25微升反應(yīng)液（Reagent D）到待測(cè)樣品孔里
• 分別加入25微升底物液（Reagent E）到所有孔里
• 輕輕搖動(dòng)96孔板
• 在37℃溫度下孵育3分鐘
• 分別加入10微升待測(cè)樣品（20微克蛋白）到所有孔里（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動(dòng)96孔板
• 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：0分鐘讀數(shù)和15分鐘讀數(shù)

 

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X樣品稀釋倍數(shù)X 0.25（體系容量；毫升）]÷[0.01（樣品容量；毫升）X 13.6（毫摩爾吸光系數(shù)）X 0.6（光徑距離；厘米）X 15（反應(yīng)時(shí)間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

 

單位＝微摩爾硫代膽堿/分鐘

注意事項(xiàng)

 

• 本產(chǎn)品為20次（比色皿）和80次（96孔板）操作 
• 操作時(shí)，須戴手套
• 每個(gè)樣品均須背景測(cè)定
• 建議使用比色皿測(cè)定
• 樣品須澄清，至關(guān)重要
• 加樣后3秒內(nèi)比色測(cè)定
• 測(cè)定值由低到高變化；測(cè)定可持續(xù)15分鐘
• 比色測(cè)定后，比色皿須清洗徹底
• 樣本測(cè)定15分鐘讀數(shù)高于0分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
• 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為100微克/50微升（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）
• 如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調(diào)整樣品濃度
• 乙酰膽堿酯酶單位活性定義為：在37℃，pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠生成1微摩爾硫代膽堿所需的酶量作為一個(gè)活性單位
• 本公司提供系列乙酰膽堿酯酶檢測(cè)試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感