銳博生物 Oncogene：miR-374a反饋環(huán)抑制鼻咽癌

方唯意教授研究團(tuán)隊(duì)近日又在Oncogene上發(fā)文證實(shí)了受PDCD4調(diào)節(jié)的miR-374a-CCND1-pPI3K/AKT-c-JUN反饋環(huán)能抑制鼻咽癌細(xì)胞生長(zhǎng)與代謝。讓我們看看這次的研究思路與結(jié)果吧。

實(shí)驗(yàn)思路與方法

miR-374a對(duì)NPC細(xì)胞的抑制作用

圖1

與陰性對(duì)照組相比，miR-374a mimic抑制細(xì)胞生長(zhǎng)（圖1a），阻礙G1/S細(xì)胞周期過(guò)渡（圖1b），還會(huì)減少細(xì)胞代謝與入侵，此外，miR-374a過(guò)表達(dá)能增強(qiáng)NPC細(xì)胞對(duì)DDP的化學(xué)敏感性。反之，用抑制劑敲除miR-374a后顯著恢復(fù)。但是，經(jīng)FACS分析檢測(cè)，miR-374a不誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。隨后在通過(guò)小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了上述結(jié)論（圖1c）。

miR-374a與細(xì)胞信號(hào)

研究者通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀察到miR-374a不僅抑制pPI3K（Tyr458），pAKT（Ser473）和c-JUN表達(dá)，而且顯著減少細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，如CCND1，c-MYC.同時(shí)，包括Snail與N-cadherin在內(nèi)的間葉細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)也下降了，而上皮標(biāo)記物E-cadherin的表達(dá)量則出現(xiàn)了增幅，但是細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白PDCD4并不受miR-374a的異常表達(dá)影響。概括來(lái)說(shuō)，這些數(shù)據(jù)表明miR-374a抑制PI3K/AKT,細(xì)胞信號(hào)與EMT（Epithelial-MesenchymalTransition），但不調(diào)節(jié)NPC的細(xì)胞凋亡。

CCND1的身份與作用

通過(guò)miRwalk與RNAhybrid演算法，預(yù)測(cè)CCND1與c-MYC是miR-374a的直接靶標(biāo)。用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)與共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)證明在NPC細(xì)胞中，CCND1,而不是c-MYC，是miR-374a的靶標(biāo)；它還能顯著減少miR-374a的表達(dá)，還增強(qiáng)了細(xì)胞生長(zhǎng)，代謝與侵襲性，降低了細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性。隨后，研究者發(fā)現(xiàn)在CCND1被敲除后，會(huì)出現(xiàn)與miR-374a過(guò)度表達(dá)后觀察到的現(xiàn)象。此外，在NPC細(xì)胞中，siRNA對(duì)c-MYC的抑制降低了pPI3K與pAKT的表達(dá)量，而CCND1的抑制誘導(dǎo)了miR-374a的表達(dá)。這表明CCND1通過(guò)c-MYC激活PI3K/AKT通道，但其發(fā)生機(jī)理不明確。

c-JUN：關(guān)鍵第四號(hào)

圖3

研究者通過(guò)生物信息學(xué)推測(cè)PI3K/AKT途徑通過(guò)調(diào)控c-JUN降低miR-374a表達(dá)。實(shí)驗(yàn)表明，減弱PI3K的磷酸化作用可減少了pAKT與c-JUN的表達(dá)（圖3a）同時(shí)刺激了miR-374a的表達(dá)（圖3b），而敲除c-JUN（圖3c）誘導(dǎo)miR-374a的表達(dá)（圖3d），這表明c-JUN是miR-374a的上游調(diào)控者。隨后我們使用染色質(zhì)免疫沉淀結(jié)合qPCR分析法發(fā)現(xiàn)c-JUN上調(diào)會(huì)使野生型miR-374a啟動(dòng)子熒光素酶活性降低，且在NPC細(xì)胞中c-JUN的抑制降低了CCND1的表達(dá)（圖3c）。

PDCD4如何抑制 NPC 細(xì)胞活動(dòng)？

研究者通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明了在5-8F細(xì)胞中PDCD4過(guò)表達(dá)顯著降低細(xì)胞遷移與侵襲性，同時(shí)降低EMT-相關(guān)基因的表達(dá)，而在PDCD4正常表達(dá)的SUNE1與HONE1細(xì)胞中觀察到相反的結(jié)果。這表明PDCD4通過(guò)EMT信號(hào)抑制細(xì)胞代謝與入侵。
 

miR-374a：我要插腳PDCD4調(diào)節(jié)

在此研究中，他們發(fā)現(xiàn)并證實(shí)在shPDCD4 NPC細(xì)胞中miR-374a顯著下調(diào)，且在PDCD4過(guò)表達(dá)時(shí)出現(xiàn)相反的影響，而c-JUN直接抑制miR-374a表達(dá)。此外還發(fā)現(xiàn)在PDCD4過(guò)表達(dá)的5-8F NPC細(xì)胞中，結(jié)合到miR-374a啟動(dòng)子上的c-JUN會(huì)顯著減少。抑制miR-374a可部分恢復(fù)CCND1與pPI3K水平，同時(shí)總PI3K或PDCD4在c-JUN敲除后未出現(xiàn)改變。這些數(shù)據(jù)表明PDCD4通過(guò)PI3K/AKT/c-JUN途徑誘導(dǎo)miR-374a表達(dá)。

捋捋三角關(guān)系

圖4

接著，他們嘗試著理清miR-374a, PDCD4與CCND1之間mRNA水平的關(guān)系。相比起正常鼻咽（NP）組織，NPC樣本中的miR-374a（圖4a，1）與PDCD4（圖4a，3）的表達(dá)水平下降，而在癌癥組織中CCND1顯著下降（圖4a，2）。這說(shuō)明miR-374a表達(dá)與CCND1表達(dá)成負(fù)相關(guān)（圖4b，1）且與PDCD4表達(dá)成正相關(guān)（圖4b，2）。此外，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析表明，CCND1表達(dá)與PDCD4表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（圖4b，3）。他們還做了存活分析，得出高CCND1、低PDCD4表達(dá)的患者預(yù)后性更差，反之，低CCND1、高PDCD4表達(dá)的患者存活時(shí)間更長(zhǎng)（圖4c）。

這篇文章的總體實(shí)驗(yàn)思路與之前的那篇文章的基本相同，綜合兩篇文章來(lái)看，我們不難發(fā)現(xiàn)miRNA在癌變過(guò)程中作為致癌基因或腫瘤抑制劑，扮演了一個(gè)舉足輕重的角色。因此，了解每一個(gè)miRNA的功能及其表達(dá)圖譜將會(huì)幫助我們驗(yàn)證它們作為診斷標(biāo)志的作用并提供癌癥治療的治療靶標(biāo)。miR-374a最初是作為某些腫瘤的致癌基因被報(bào)道的，但在此文章以及其他文章報(bào)道中則有相反的結(jié)果，這說(shuō)明miRNA的分子功能與基礎(chǔ)都是極其復(fù)雜與矛盾的，不能一概而論，同時(shí)鼓勵(lì)我們進(jìn)行更多的研究來(lái)探索每個(gè)miRNA在特定環(huán)境中的作用。

原文：miR-374a-CCND1-pPI3K/AKT-c-JUN feedback loop modulated by PDCD4 suppresses cell growth, metastasis, and sensitizes nasopharyngeal carcinoma to cisplatin

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