聚合物和多糖的物理性質(zhì)及行為極大程度上取決于其分子本身的性質(zhì)。分子量和分子量分布、分子大小和結(jié)構(gòu)都會(huì)影響物質(zhì)的行為特性。凝膠滲透色譜(GPC)，又稱(chēng)為尺寸排阻色譜(SEC)，是用來(lái)評(píng)估這些參數(shù)最常用的工具。

GPC的工作原理涉及在樣品流經(jīng)多孔的惰性色譜柱基質(zhì)時(shí)對(duì)樣品進(jìn)行分離。較小的分子進(jìn)入填料孔內(nèi)，而較大的分子則被排除在外，因此可更快速地通過(guò)色譜柱。結(jié)果是得到一個(gè)基于流體力學(xué)體積的分離，而我們想要知道的是樣品的分子量。以前，分子量是通過(guò)對(duì)比樣品洗脫時(shí)間與已知分子量標(biāo)準(zhǔn)品洗脫時(shí)間進(jìn)行估算。而現(xiàn)在，光散射檢測(cè)器是在不依賴(lài)保留時(shí)間的情況下對(duì)聚合物分子量進(jìn)行測(cè)量的常用工具。使用多角度光散射(MALS)和特性粘度進(jìn)行的Rg并行測(cè)量提供了對(duì)合成和天然聚合物分子結(jié)構(gòu)及其分子量的優(yōu)異檢測(cè)結(jié)果。

Viscotek SEC-MALS 20（圖1）是一種有20個(gè)角度的光散射檢測(cè)器，可以測(cè)量分子量和Rg（回轉(zhuǎn)半徑）。該檢測(cè)器可用作多角度檢測(cè)器GPC系統(tǒng)的一部分，與光散射及其他檢測(cè)器如示差折光(RI)、紫外光(UV)和特性粘度(IV)結(jié)合使用，以同時(shí)生成大量的樣品信息。

此應(yīng)用說(shuō)明中，將采用 Viscotek SEC-MALS 20 測(cè)得的分子量數(shù)據(jù)與Rg和IV測(cè)量值相結(jié)合，用于研究不同多糖的分子結(jié)構(gòu)，包括支鏈淀粉、葡聚糖、羥丙基纖維素(HPC)、果膠和阿拉伯膠。此外，還對(duì)構(gòu)象圖與Mark-Houwink圖之間的差異進(jìn)行了研究。

圖1：Viscotek SEC-MALS 20系統(tǒng)

材料和方法
將SEC-MALS 20檢測(cè)器連接至Viscotek GPCmax和 Viscotek TDA系統(tǒng)。通過(guò)使用2根Viscotek A6000M色譜柱（葡聚糖、果膠和阿拉伯膠）或1根色譜柱（支鏈淀粉、羥丙基纖維素）分離樣品。流動(dòng)相是磷酸鹽緩沖液。SEC-MALS 20 系統(tǒng)經(jīng) 19kDa PEO 標(biāo)準(zhǔn)樣進(jìn)行校正。檢測(cè)器和色譜柱均維持在35°C，以確保良好的分離并使基線穩(wěn)定性最大化。

所有樣品均以 0.5至3 mg/ml的濃度溶解于流動(dòng)相中，并以100µl體積進(jìn)行進(jìn)樣。葡聚糖樣品的分子量已知，可用于檢查校正結(jié)果。所有樣品均需溶解一整夜，以確保完全溶解。

結(jié)果

所有樣品均在系統(tǒng)內(nèi)成功分離。顯示了果膠、阿拉伯膠和葡聚糖（圖 2A）及支鏈淀粉和 HPC（圖 2B）的 RI疊加色譜圖。

圖 2A：果膠、葡聚糖和阿拉伯膠的RI疊加色譜圖

 圖 2B： 支鏈淀粉和 HPC 的 RI 疊加色譜圖。

作為一個(gè)更詳細(xì)的示例，圖 3A 展示了果膠的色譜圖，顯示了 RI、LS (90°)和IV檢測(cè)器的結(jié)果。圖3B顯示了SEC-MALS 20檢測(cè)器的角度數(shù)據(jù)。從不同的角度可看出輕微的角度依賴(lài)性，允許對(duì)該樣品的Rg進(jìn)行測(cè)量。圖3C顯示RI峰值與所測(cè)得的分子量、Rg、IV 和 Rh 重疊。

圖3：A.顯示果膠RI（紅色）、LS (90°)（橙色）和 IV（藍(lán)色）檢測(cè)器響應(yīng)的色譜圖。B.顯示 MALS 數(shù)據(jù)的曲線。C. 顯示與所測(cè)得的 Rg（栗色）、分子量（黑色）、IV（藍(lán)綠色）和 Rh（青色）重疊的 RI 峰值衍生數(shù)據(jù)。

    表1總結(jié)了不同樣品的結(jié)果。研究中進(jìn)行了重復(fù)進(jìn)樣，每次進(jìn)樣之間的所有測(cè)量值表現(xiàn)出極佳的可重復(fù)性。

雖然研究數(shù)值結(jié)果是比對(duì)樣品的一個(gè)不錯(cuò)的定量方法，然而將數(shù)據(jù)繪制在MarkHouwink圖和構(gòu)象圖上，從視覺(jué)角度來(lái)看也是一個(gè)快速比對(duì)樣品的理想方式。MarkHouwink圖顯示了作為分子量函數(shù)的特性粘度，而構(gòu)象圖則顯示了作為分子量函數(shù)的Rg 值。因此，二者均可作為觀察分子大小隨著分子量的增加而增大的一個(gè)方式。均可在不同樣品之間進(jìn)行即時(shí)比對(duì)，同時(shí)也非常適合于研究支化和其他結(jié)構(gòu)變化。而在本例中，我們只重點(diǎn)關(guān)注不同的多糖在曲線上的分布情況。

表 1：測(cè)得的不同多糖樣品的分子量分布、IV、Rh 和 Rg 值。   

圖 4A：多糖的 Mark-Houwink 疊加圖。

圖 4B：多糖的構(gòu)象疊加圖。 實(shí)線表示實(shí)際數(shù)據(jù)，虛線表示外推數(shù)據(jù)。

討論

在對(duì) Mark-Houwink 和構(gòu)象圖進(jìn)行研究時(shí)，結(jié)果中所包含的信息隨即變得清晰起來(lái)。阿拉伯膠是樣品中分子量最高的，然而，它在兩個(gè)圖中的曲線卻是“最低的”：在質(zhì)量上，它是所研究分子中最小的（構(gòu)象圖）或是密度最大的（Mark-Houwink 圖）。雖然阿拉伯膠主要是多糖，但通常也含有蛋白質(zhì)成分，這使其在僅增加了較小分子大小的同時(shí)增加了分子質(zhì)量，所以上述結(jié)果也是意料之中的。

另一方面，果膠在兩個(gè)圖中的曲線都是最長(zhǎng)的，這表明它是所研究分子中分散性最大的分子。這與其在色譜圖中擁有最寬的峰是一致的。這一點(diǎn)在 Mark-Houwink 圖上比在構(gòu)象圖上體現(xiàn)得更清楚。由于顯示了Rg，構(gòu)象圖僅針對(duì)半徑約在10nm的分子，該半徑的樣品光散射是各向異性的。 果膠分布圖中包含了一些低于該半徑限值的物質(zhì)，無(wú)法測(cè)量其Rg。IV不受分子大小的限制，因此可在整個(gè)分子量分布中進(jìn)行測(cè)量。作為兩個(gè)圖中“最高的”分子，果膠將其自身標(biāo)識(shí)為所研究分子中最大（構(gòu)象圖）且密度最�。∕ark-Houwink 圖）的分子。

HPC、支鏈淀粉和葡聚糖分布于果膠和阿拉伯膠樣品之間，表明其結(jié)構(gòu)介于這兩個(gè)極端值之間。

雖然這兩個(gè)圖給出的信息類(lèi)似，但值得注意的是，其各自的優(yōu)缺點(diǎn)使其適用的應(yīng)用各不相同。如上所述，構(gòu)象圖不可用于較小的分子。然而，作為分子大小的直接測(cè)量方法，它并不依賴(lài)于任何形狀模型。如需將 IV 轉(zhuǎn)換為大小值，必須假定一些形狀模型，如表1中的Rh計(jì)算。
總之，在此應(yīng)用說(shuō)明中，所選多糖的分子量、大小和特性粘度是通過(guò) Viscotek TDA和SEC-MALS 20系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)量的。然后繪制出構(gòu)象圖和Mark-Houwink圖，二者均清晰地顯示出不同樣品的不同結(jié)構(gòu)。從數(shù)據(jù)可以看出，不同的多糖之間分子結(jié)構(gòu)的差異非常明顯，很容易觀察出來(lái)。

以前，使用單檢測(cè)器GPC系統(tǒng)無(wú)法得出此種程度的表征結(jié)果。通過(guò)將光散射和特性粘度檢測(cè)器與GPC結(jié)合使用，則可對(duì)天然和合成聚合物樣品進(jìn)行詳細(xì)的表征。