當(dāng)前位置 > 首頁 > 技術(shù)文章 > BioTNT mRNA 引物篩選，引物定制或specific primers的使用說明書

選型 | 市場 | 應(yīng)用 | 使用 | 法規(guī) | 技術(shù) | 其他

BioTNT mRNA 引物篩選，引物定制或specific primers的使用說明書

瀏覽次數(shù)：2838　發(fā)布日期：2014-8-27　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

版本號(hào)：20100001

BioTNT qPCR Primer Assay for specific mRNA genes

目錄號(hào)：SER-PCR –編號(hào)（500T）;

說明書 Part A

一、產(chǎn)品簡介：

本試劑盒是基于最可靠的SYBR® Green-based定量real-time PCR試劑盒并應(yīng)用基因表達(dá)分析。

我們的實(shí)驗(yàn)為基因特異性定量PCR驗(yàn)證具有統(tǒng)一、高效和標(biāo)準(zhǔn)化特點(diǎn)的擴(kuò)增反應(yīng)條件。

每一對(duì)引物都是經(jīng)過嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的。

已經(jīng)使用適當(dāng)?shù)膔eal time PCR Mix的時(shí)候，合適的片段大小和高的擴(kuò)增效率成為保證。

qRT-PCR Primer pair kits統(tǒng)一的擴(kuò)增效率和條件為熒光定量pcr實(shí)驗(yàn)中多基因表達(dá)的檢測提供了準(zhǔn)確而靈活的解決方案。

完整的試劑盒說明書由part A 和Part B構(gòu)成。Part A 主要描述了本試劑盒的使用方法和注意事項(xiàng)，Part B主要注明了assay 的特異情況。

二、產(chǎn)品特點(diǎn)：

本產(chǎn)品適用于有一定q PCR實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)的客戶或者無經(jīng)驗(yàn)的客戶在公司的技術(shù)指導(dǎo)下進(jìn)行。

三、保存條件：

可在常溫下運(yùn)輸。常期保存請(qǐng)?jiān)?20℃保存，效期12個(gè)月。

警告：本產(chǎn)品僅供科研使用，請(qǐng)勿用于醫(yī)藥、臨床治療、食品及化妝品等其他用途。

安全提示：本產(chǎn)品中部分試劑有腐蝕性或毒性，請(qǐng)勿直接接觸皮膚或吞咽；操作時(shí)請(qǐng)穿戴實(shí)驗(yàn)服、防護(hù)鏡和手套；如果接觸皮膚，應(yīng)立即用洗滌劑和大量清水沖洗；誤食或其他危急情況，請(qǐng)及時(shí)到醫(yī)院就治；部分試劑易燃，請(qǐng)注意消防安全。

四、注意事項(xiàng)：

請(qǐng)?jiān)谑盏酱嗽噭┖泻罅⒖虣z查試劑盒組成，BioTNT 公司只負(fù)責(zé)受理在試劑盒簽收后三個(gè)工作日內(nèi)的試劑缺失報(bào)告；

五、試劑盒組成：

試劑	說明	T
qPCR上游引物	10×	1ml （500T）
qPCR下游引物	10×	1ml （500T）

其他特點(diǎn)請(qǐng)參照Part B。

六、保證結(jié)果可使用的qPCR試劑：

BioTNT real time PCR Premix 貨號(hào)：A2010A0112

七、其他需要自己準(zhǔn)備的：

1、耗材：0.5 mL或1.5mL Eppendorf管（無菌、無酶、RNase-free；貨號(hào)），Tips(RNase-free)（1000μL、200μL、10μL的槍頭；）；

2、檢測的樣本CDNA；

3、無菌無酶的 PCR 水（貨號(hào)：A2010B0X03）；

4、離心機(jī)；移液器（10μL ，200μL，1000μL）；

5、手套，口罩。

八、預(yù)防RNase污染，應(yīng)注意以下幾個(gè)方面：

1、經(jīng)常更換新手套，以防止RNase污染；

2、使用無RNase的塑料制品和槍頭避免交叉污染；

3、 RNA在Rrizol試劑中時(shí)短時(shí)間內(nèi)不會(huì)被RNase降解，但提取后繼續(xù)處理過程中應(yīng)使用不含RNase的塑料或玻璃器皿（玻璃器皿可在150℃燒烤4小時(shí)，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10分鐘，然后用DEPC水徹底清洗，再滅菌，即可去除RNase）；

4、配制溶液應(yīng)使用RNase-free ddH₂O（貨號(hào)：A2010B0X03）

九、操作步驟：

1、請(qǐng)混勻所有的試劑（15秒）；

2、請(qǐng)按以下配比對(duì)每個(gè)反應(yīng)配20μL的體系：

反應(yīng)液組份	用于熒光PCR實(shí)驗(yàn)
反應(yīng)液組份	加量 (μL)	終濃度	備注
Real time PCR Premix試劑混合物	10	1×	貨號(hào)：
上游引物（10×）	2	1×
下游引物（10×）	2	1×
待檢DNA樣品	1		用戶提供*
PCR水	5
總體積	20

*注意：如果您的cDNA模板不是使用BioTNT的cDNA第一鏈合成試劑盒（貨號(hào)：A2010B0B01，A2010B0B02）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成的，請(qǐng)適當(dāng)?shù)恼{(diào)整cDNA的用量（1-6μL），調(diào)整無菌去離子水的用量，使總體積保持20μL；

*注意：如果您不使用BioTNT real time PCR Premix，請(qǐng)做引物濃度梯度實(shí)驗(yàn)，以使實(shí)驗(yàn)達(dá)到最佳效果；

*注意：建議MIX引物、標(biāo)本與PCR水預(yù)混，在實(shí)驗(yàn)操作中盡量避免使用移液器的最小量程，盡量減少加樣次數(shù)，以減少因加樣而導(dǎo)致的誤差。在操作中，應(yīng)使用不含熒光物質(zhì)的一次性手套(經(jīng)常替換)、移液器頭(帶濾嘴自卸式)，不能用手直接觸摸PCR反應(yīng)管/條/板。

*注意：如果使用其他體積的體系（5-50μl），應(yīng)保證終濃度與說明書上的終濃度一致。配制反應(yīng)體系時(shí)，應(yīng)注意移液器的使用方法，所有的液體都要緩慢加至管底，不要加至管壁，所有液體的混勻要用振蕩器進(jìn)行，不能用移液器吹打，避免產(chǎn)生氣泡。如果產(chǎn)生氣泡，請(qǐng)用手指將氣泡彈破，再低速離心。反應(yīng)體系配制完畢后低速離心數(shù)秒，立即進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

*大多數(shù)儀器建議采用20ul體系；Roche的lightcycler 和ABI 7900，stepone plus，viia7 等可以采用10ul體系；

*建議每個(gè)樣本同一個(gè)基因做雙重復(fù)或者三重復(fù)；

*設(shè)立陰性對(duì)照(即加樣品的時(shí)候用水來代替);

*建議購買BioTNT 的陽性對(duì)照( 貨號(hào): A2010B0X10 ); 并在實(shí)驗(yàn)中設(shè)立陽性對(duì)照;

1、低速離心數(shù)秒，并且按照熒光PCR儀的使用說明放置好您的PCR管/條/板；

2、從下列表中選擇最合適的實(shí)驗(yàn)反應(yīng)條件，按照熒光PCR儀的使用說明設(shè)置好PCR反應(yīng)條件：

熒光PCR儀	循環(huán)	時(shí) 間	溫度
ABI: 5700, 7000, 7300, 7500, 7700, 7900HT, StepOnePlus BioRad: iCycler^®, iQ5, MyIQ Stratagene: Mx3000p, Mx3005p, Mx4000p Eppendorf: Mastercycler® ep realplex	1	5 minutes [1]	95℃
	40	15 seconds	95℃
	40	1 minute [2]	60℃
Roche*: LightCycler 480®	1	5 minutes [1]	95℃
	45	15 seconds	95℃
	45	1 minute [2]	60℃

*注意羅氏LightCycler 480 ®用戶：請(qǐng)調(diào)整升溫速率為1℃/秒。更多關(guān)于其他所需的改變和熔融曲線設(shè)置的信息請(qǐng)參閱儀器安裝指南。

3、下列儀器使用三個(gè)步驟的循環(huán)程序：

熒光PCR儀	循環(huán)	時(shí) 間	溫度
BioRad: CFX96, CFX384, Opticon, Opticon 2, Chromo 4 (MJ Research) Takara: TP-800 All other instruments	1	5 minutes [1]	95℃
	40	15 seconds	95℃
		20 到30 seconds	60℃
		30 seconds [2、3]	72℃

[1]95℃ 5分鐘的步驟是為了激活熱啟動(dòng)DNA聚合酶。

[2]檢測并記錄熒光染料熒光信號(hào)在每個(gè)周期的延伸結(jié)束時(shí)。

[3]不同的儀器需要檢測熒光信號(hào)的時(shí)間長短不同，請(qǐng)根據(jù)您的儀器選擇適當(dāng)?shù)难由鞎r(shí)間。

反應(yīng)條件示例：95℃ 5分鐘→95℃ 15秒→60℃ 30秒（讀板）→溶解曲線分析；

40個(gè)循環(huán)

注：以上反應(yīng)條件是應(yīng)用BioTNT 染料法premix（貨號(hào)：A2010A0112），在ABI stepone plus上的反應(yīng)條件。請(qǐng)注意，第一步95℃ 5分鐘是BioTNT premix的hot start的特點(diǎn)，如使用其他公司的premix，請(qǐng)調(diào)整這一步的反應(yīng)時(shí)間。

十、實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷:

i.陽性對(duì)照(或者客戶的陽性模板)的內(nèi)參基因的熔解曲線呈單峰，其Tm與引物說明書上的產(chǎn)物Tm相近；擴(kuò)增曲線呈S型；雙重復(fù)重復(fù)良好（Ct值相差不超過1），說明加樣誤差和儀器誤差比較小，可用；如果 CT相差超過1.5，該數(shù)據(jù)不可用，需要重新檢測；

ii.陰性孔Ct＞33，熔解曲線在目的產(chǎn)物或內(nèi)參產(chǎn)物峰處無明顯特異性產(chǎn)物峰出現(xiàn)，說明實(shí)驗(yàn)體系無污染，數(shù)據(jù)可信；

iii.內(nèi)參實(shí)驗(yàn)的CT值在15-25之間，可根據(jù)文獻(xiàn)來確定內(nèi)參基因CT應(yīng)該在的區(qū)域，來進(jìn)行數(shù)據(jù)判斷，抽提和逆轉(zhuǎn)錄的可靠性；

iv.其他情況請(qǐng)參考實(shí)驗(yàn)疑難分析與解答或咨詢公司技術(shù)人員。

十一：內(nèi)參基因的選擇：

1、對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的內(nèi)參基因，盡量少受實(shí)驗(yàn)干預(yù)的影響；可以進(jìn)行多個(gè)內(nèi)參基因的比較，選擇較少受實(shí)驗(yàn)干預(yù)影響的內(nèi)參基因；

2、請(qǐng)選擇與目的基因CT比較接近的內(nèi)參基因，來作為實(shí)驗(yàn)的內(nèi)參基因，進(jìn)行均一化處理。

十二、Trouble shooting

問題	解決
樣本沒有擴(kuò)增曲線	查看儀器設(shè)置，是否設(shè)置正確的熒光讀板時(shí)間，不同機(jī)器有不同的讀板方式；即使沒有擴(kuò)增，也會(huì)有熒光檢測曲線；ABI 機(jī)器在部分錯(cuò)誤設(shè)置時(shí)，不能顯示正確的擴(kuò)增曲線；ABI機(jī)器可以查看儀器的原始熒光信號(hào)；
樣本沒有熔解曲線	查看熔解曲線設(shè)置是否正確；
雜亂的熔解曲線	可能沒有產(chǎn)物；查看BioTNT microRNA assay提供的陽性CDNA對(duì)照進(jìn)行real time PCR 擴(kuò)增結(jié)果如何；
熔解曲線峰與BioTNT microRNA assay 中提供的tm 值不一致	與公司的技術(shù)部聯(lián)系
陰性對(duì)照有擴(kuò)增曲線，且熔解曲線峰與目的產(chǎn)物峰相同	被污染，注意加樣和PCR的防污染措施