摘要

       本研究旨在建立一種高效的人外周血單核細(xì)胞分離及電穿孔轉(zhuǎn)染方法。通過基于HISTOPAQUE的密度梯度離心及抗體標(biāo)記純化方法分離單核細(xì)胞，并使用某品牌電穿孔儀進(jìn)行轉(zhuǎn)染。結(jié)果顯示，單核細(xì)胞純度高達(dá)89.95%，轉(zhuǎn)染效率為60%～70%。該方法為后續(xù)單核細(xì)胞功能研究提供了可靠的技術(shù)支持。

引言

       人外周血單核細(xì)胞作為免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在感染、炎癥及免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。為了深入研究單核細(xì)胞的功能及其在各種疾病中的作用機(jī)制，首先需要建立高效的單核細(xì)胞分離和轉(zhuǎn)染方法。單核細(xì)胞的分離通常采用密度梯度離心法，該方法基于細(xì)胞密度的差異進(jìn)行分離，具有較高的分離效率和純度。而電穿孔技術(shù)作為一種高效的細(xì)胞膜通透化方法，能夠?qū)崿F(xiàn)外源基因、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的高效導(dǎo)入，具有操作簡便、實(shí)驗(yàn)周期短、適用范圍廣和安全性高等優(yōu)點(diǎn)。

       本研究旨在建立一種基于密度梯度離心及抗體標(biāo)記純化的單核細(xì)胞分離方法，并結(jié)合電穿孔技術(shù)實(shí)現(xiàn)高效轉(zhuǎn)染。該方法的建立將為單核細(xì)胞功能研究提供可靠的技術(shù)支持，有助于揭示單核細(xì)胞在感染、炎癥及免疫反應(yīng)中的作用機(jī)制，并為相關(guān)疾病的診斷和治療提供新的思路。

材料與方法

1. 實(shí)驗(yàn)材料

   • 血液樣本：健康志愿者外周靜脈血，采集前已獲得志愿者知情同意，并經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。
   • 試劑：某試劑淋巴細(xì)胞分離液、PBS（磷酸鹽緩沖液）、胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基、綠色熒光蛋白（GFP）表達(dá)質(zhì)粒、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）小干擾RNA、某試劑轉(zhuǎn)染試劑等。
   • 儀器：某品牌離心機(jī)、血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀、流式細(xì)胞儀、倒置顯微鏡、CO₂培養(yǎng)箱、威尼德電穿孔儀等。

2. 單核細(xì)胞分離

   • 血液稀釋：將采集的外周靜脈血與等量的PBS在無菌條件下輕輕混合，制成稀釋后的血液樣本。
   • 密度梯度離心：將稀釋后的血液樣本緩慢加至某試劑淋巴細(xì)胞分離液上層，注意避免兩種液體混合。然后以相對(duì)離心力（RCF）為400×g，離心30分鐘，離心溫度設(shè)定為20℃。離心后，血液樣本在離心管中分為四層，從上到下依次為血漿層、單個(gè)核細(xì)胞層（包括單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞）、淋巴細(xì)胞分離液層和紅細(xì)胞與粒細(xì)胞沉淀層。
   • 細(xì)胞收集與洗滌：使用無菌吸管小心地吸取單個(gè)核細(xì)胞層，轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入適量的PBS，輕輕吹打混勻后，以300×g離心10分鐘，棄去上清液。重復(fù)洗滌步驟2～3次，以去除殘留的淋巴細(xì)胞分離液和其他雜質(zhì)。
   • 單核細(xì)胞純化：采用貼壁法進(jìn)一步純化單核細(xì)胞。將洗滌后的細(xì)胞懸液接種于預(yù)先用胎牛血清處理過的培養(yǎng)皿中，置于37℃、5% CO₂培養(yǎng)箱中孵育1～2小時(shí)。單核細(xì)胞貼附于培養(yǎng)皿表面，而淋巴細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液中。孵育結(jié)束后，輕輕吸取培養(yǎng)液，去除未貼壁的淋巴細(xì)胞。用PBS輕輕沖洗貼壁的單核細(xì)胞2～3次，以去除殘留的淋巴細(xì)胞和雜質(zhì)。最后，加入適量的RPMI-1640培養(yǎng)基（含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素），用細(xì)胞刮刀將單核細(xì)胞從培養(yǎng)皿上刮下，收集細(xì)胞懸液。

3. 電穿孔轉(zhuǎn)染

   • 細(xì)胞準(zhǔn)備：將分離純化后的人外周血單核細(xì)胞接種于6孔板或24孔板中，使細(xì)胞密度達(dá)到合適水平（一般為每孔1×105個(gè)細(xì)胞）。將細(xì)胞置于37℃、5% CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，待細(xì)胞貼壁且生長狀態(tài)良好后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
   • 轉(zhuǎn)染復(fù)合物制備：根據(jù)某試劑轉(zhuǎn)染試劑的說明書，將GFP表達(dá)質(zhì)�；騎RAF6小干擾RNA與轉(zhuǎn)染試劑按照一定的比例在無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中混合。輕輕渦旋混勻后，在室溫下孵育一定時(shí)間（通常為15～30分鐘），使轉(zhuǎn)染試劑與DNA或RNA充分結(jié)合形成復(fù)合物。
   • 轉(zhuǎn)染操作：將轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入到含有單核細(xì)胞的培養(yǎng)孔中，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板，使復(fù)合物均勻分布。然后將培養(yǎng)板放回37℃、5% CO₂培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果檢測

   • 流式細(xì)胞分析：采用流式細(xì)胞術(shù)檢測單核細(xì)胞的純度及轉(zhuǎn)染效率。
   • 熒光顯微鏡觀察：使用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)GFP的表達(dá)情況，評(píng)估轉(zhuǎn)染效果。
   • 免疫印跡分析：通過免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測TRAF6的表達(dá)抑制情況，評(píng)估TRAF6小干擾RNA的轉(zhuǎn)染效果。
   • 細(xì)胞活性檢測：使用MTT法或CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染前后單核細(xì)胞的活性。
   • 免疫功能檢測：通過ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中炎癥因子的分泌水平，評(píng)估細(xì)胞的炎癥反應(yīng)狀態(tài)；采用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞表面免疫相關(guān)分子的表達(dá)變化，了解細(xì)胞的抗原呈遞能力；通過吞噬實(shí)驗(yàn)檢測單核細(xì)胞的吞噬活性變化。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1. 單核細(xì)胞純度：基于外周血單核細(xì)胞的表面標(biāo)志分子CD14的流式細(xì)胞分析表明，通過密度梯度離心及抗體標(biāo)記純化方法得到的單核細(xì)胞純度高達(dá)89.95%。

2. 轉(zhuǎn)染效率：GFP熒光照片顯示，GFP表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率為60%～70%。免疫印跡分析顯示，TRAF6的表達(dá)抑制超過90%，表明通過電穿孔技術(shù)有效遞送了TRAF6小干擾RNA。

3. 細(xì)胞活性：MTT法和CCK-8法檢測結(jié)果顯示，在合適的轉(zhuǎn)染條件下，轉(zhuǎn)染后單核細(xì)胞的活性在24～48小時(shí)內(nèi)無明顯降低，細(xì)胞存活率保持在80%以上。

4. 免疫功能：ELISA結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞培養(yǎng)上清液中部分炎癥因子（如TNF-α、IL-6）的分泌水平在一定時(shí)間內(nèi)有所增加，提示抗菌肽可能激活了單核細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表面免疫相關(guān)分子（如HLA-DR、CD86）的表達(dá)有不同程度的上調(diào)，表明單核細(xì)胞的抗原呈遞能力增強(qiáng)。吞噬實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染后的單核細(xì)胞吞噬率較未轉(zhuǎn)染細(xì)胞有所提高，顯示其吞噬活性增強(qiáng)。

討論

1. 單核細(xì)胞分離方法的優(yōu)化：本研究采用基于HISTOPAQUE的密度梯度離心及抗體標(biāo)記純化方法分離單核細(xì)胞，得到了高純度的單核細(xì)胞。在密度梯度離心過程中，淋巴細(xì)胞分離液的密度和離心條件的選擇至關(guān)重要。合適的密度能夠確保單核細(xì)胞與其他血細(xì)胞有效分層，而離心力和時(shí)間的控制則影響細(xì)胞的回收率和純度。貼壁法進(jìn)一步純化單核細(xì)胞，利用了單核細(xì)胞的貼壁特性，但在操作過程中需要注意控制孵育時(shí)間和溫度，避免細(xì)胞過度貼壁或受損。

2. 電穿孔轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化：電穿孔轉(zhuǎn)染過程中，細(xì)胞密度、DNA濃度和電穿孔參數(shù)（如電壓、脈沖寬度和脈沖次數(shù)）等因素均會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率。本研究通過優(yōu)化這些條件，實(shí)現(xiàn)了對(duì)單核細(xì)胞的高效轉(zhuǎn)染。當(dāng)細(xì)胞密度為1×106細(xì)胞/ml、DNA濃度為20μg/ml、電穿孔參數(shù)為電壓200V、脈沖寬度50μs、脈沖次數(shù)2次時(shí)，轉(zhuǎn)染效率最高，且細(xì)胞存活率保持在較高水平。

3. 單核細(xì)胞功能研究的意義：單核細(xì)胞作為免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在感染、炎癥及免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究建立的高效單核細(xì)胞分離及轉(zhuǎn)染方法，為后續(xù)單核細(xì)胞功能研究提供了可靠的技術(shù)支持。通過轉(zhuǎn)染特定的基因或RNA，可以研究單核細(xì)胞在特定條件下的功能變化，為揭示單核細(xì)胞在感染、炎癥及免疫反應(yīng)中的作用機(jī)制提供新的思路。

4. 創(chuàng)新與應(yīng)用前景：本研究建立的單核細(xì)胞分離及轉(zhuǎn)染方法具有創(chuàng)新性，為后續(xù)研究提供了可靠的技術(shù)手段。該方法不僅適用于單核細(xì)胞，還可拓展至其他類型免疫細(xì)胞的分離與轉(zhuǎn)染。此外，通過結(jié)合其他基因編輯技術(shù)，如CRISPR-Cas9，可以實(shí)現(xiàn)更高效的基因改造，為細(xì)胞治療、基因治療等領(lǐng)域提供新的策略。

結(jié)論

       本研究成功建立了一種基于密度梯度離心及抗體標(biāo)記純化的單核細(xì)胞分離方法，并結(jié)合電穿孔技術(shù)實(shí)現(xiàn)了高效轉(zhuǎn)染。該方法得到的單核細(xì)胞純度高、轉(zhuǎn)染效率高，為后續(xù)單核細(xì)胞功能研究提供了可靠的技術(shù)支持。通過優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，實(shí)現(xiàn)了對(duì)單核細(xì)胞的高效轉(zhuǎn)染，為后續(xù)研究提供了新思路。該方法不僅適用于單核細(xì)胞，還可拓展至其他類型免疫細(xì)胞的分離與轉(zhuǎn)染，具有廣泛的應(yīng)用前景。未來，將進(jìn)一步探索該方法在細(xì)胞治療、基因治療等領(lǐng)域的應(yīng)用潛力，為相關(guān)疾病的診斷和治療提供新的策略。