一、細胞消化酶的重要性

在細胞培養(yǎng)過程中，消化酶起著至關重要的作用。細胞消化酶能夠使細胞從組織中分離出來，為后續(xù)的實驗研究提供純凈的細胞樣本。消化酶通過特異性地降解細胞間的連接物質，如蛋白質、膠原蛋白等，使細胞能夠從組織中脫離出來，成為單個細胞懸液。

例如，胰蛋白酶是目前應用最為廣泛的消化酶之一。它對精氨酸和賴氨酸肽鏈具有選擇性水解作用，可使細胞間的蛋白質水解從而使細胞離散。不同的組織或者細胞對胰酶的作用反應不一樣，其活性還與濃度、溫度和作用時間有關。在 pH為8.0、溫度為37℃時，胰酶溶液的作用能力最強。

膠原酶也是常用的細胞消化酶。膠原酶通過水解細胞間質的脯氨酸，從而使細胞離散。它對膠原的消化作用很強，僅對細胞間質有消化作用而對細胞損害不大，適于消化分離纖維性組織、上皮和較硬的癌組織。鈣鎂離子和血清不會對膠原酶的活性及消化作用產(chǎn)生影響。膠原酶可細分為不同類型，適用范圍也各不相同。

此外，透明質酸酶常與膠原酶等聯(lián)合使用，用于結締組織的分離；脫氧核糖核酸酶Ⅰ配合膠原酶或透明質酸酶等聯(lián)合使用，防止DNA導致的細胞凝集；中性蛋白酶與膠原酶等聯(lián)合使用，分離纖維樣組織效率高；彈性蛋白酶與胰蛋白酶和膠原酶等聯(lián)合使用，用于分離結締組織和含有大量細胞網(wǎng)狀纖維的組織。

綜上所述，細胞消化酶在細胞培養(yǎng)中具有不可替代的重要作用，為細胞生物學研究和臨床應用提供了關鍵的技術支持。

二、常見消化酶種類及特點

（一）胰蛋白酶

胰蛋白酶是一種胰腺絲氨酸蛋白酶，對堿性氨基酸、精氨酸和賴氨酸的羧基參與的肽鍵具有特異性。它能使天然蛋白、變性蛋白、纖維蛋白和黏蛋白等水解為多肽或氨基酸，主要是動物胰臟合成的胰蛋白酶原前體在腸道中受腸激酶活化而產(chǎn)生，商業(yè)用胰蛋白酶多是重組大腸桿菌表達生產(chǎn)的。胰蛋白酶適用于消化細胞間質較少的軟組織，但對纖維組織和硬癌組織效果差。在組織解離的時候，純化的胰蛋白酶需要與其它酶如膠原酶聯(lián)合使用。

（二）膠原酶

膠原酶主要水解結締組織中膠原蛋白成分。目前商用膠原酶是從溶組織梭狀細胞芽孢桿菌提取制備的，分為 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ 等不同類型，要根據(jù)所要分離消化的組織類型選擇膠原酶類型。膠原酶對膠原的消化作用很強，僅對細胞間質有消化作用而對細胞損害不大，適于消化分離纖維性組織、上皮和較硬的癌組織。鈣鎂離子和血清不會對膠原酶的活性及消化作用產(chǎn)生影響。

（三）透明質酸酶

透明質酸酶是能使透明質酸產(chǎn)生水解作用酶的總稱，廣泛分布于自然界中。透明質酸是一種酸性粘多糖，在 ECM 中具有限制水分及其它胞外物質擴散的作用，在各種結締組織和皮膚中含量豐富。透明質酸酶通過降解透明質酸，常與膠原酶聯(lián)合用于結締組織分離。

（四）脫氧核糖核酸酶

脫氧核糖核酸酶Ⅰ是一種可以消化單鏈或雙鏈 DNA 產(chǎn)生單脫氧核苷酸或單鏈或雙鏈的寡脫氧核苷酸的核酸內(nèi)切酶。在細胞分離過程中，它作用于細胞分離降解出的 DNA，防止細胞凝集，一般不單獨使用，而是配合膠原酶或透明質酸酶等聯(lián)合使用。

（五）中性蛋白酶

中性蛋白酶也稱分散酶，來源于枯草桿菌，具有比較溫和的蛋白水解酶活性，對細胞損傷小且可維持細胞膜完整性。它主要用來從各種不同組織或器官中消化細胞外基質，釋放并制備原代單細胞，或用于細胞培養(yǎng)中的細胞收獲和接種轉移，也被用于防止懸浮細胞培養(yǎng)時的細胞意外結團。常與膠原酶聯(lián)合使用。

（六）彈性蛋白酶

彈性蛋白酶是豬胰腺來源的一種絲氨酸蛋白酶，催化蛋白和多肽水解，尤其是僅次于中性氨基酸殘基的肽鍵，能水解天然彈力素。它常與胰蛋白酶和膠原酶聯(lián)合用于結締組織分離，例如用于解離包含大量細胞間纖維網(wǎng)絡的組織，也用于從肺泡中分離 ATII 細胞。

三、不同細胞對消化酶的選擇依據(jù)

（一）軟組織細胞

如胚胎、上皮、肝、腎等組織細胞，常選用胰蛋白酶或與其他酶聯(lián)合使用。這是因為胰蛋白酶適用于消化細胞間質較少的軟組織，能有效地分離這些組織細胞。例如，在分離胚胎細胞時，胰蛋白酶可以作用于賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，使細胞間質中的蛋白質水解，從而使細胞分散開。然而，對于一些較為特殊的軟組織細胞，單純使用胰蛋白酶可能效果不佳，此時可以考慮與其他酶聯(lián)合使用。比如，與膠原酶合用，可以增加對組織的分離作用。據(jù)研究表明，在分離上皮組織細胞時，胰蛋白酶與膠原酶聯(lián)合使用，能夠更有效地分離細胞，提高細胞的純度和活性。

（二）纖維性組織和癌組織細胞

適合膠原酶，因其對這類細胞損傷小，能有效分離細胞。膠原酶對膠原的消化作用很強，僅對細胞間質有消化作用，對細胞的損害小，因此適于消化分離纖維性組織和較硬的癌組織。不同類型的膠原酶適用范圍不同，如膠原酶Ⅰ適用于大多數(shù)組織；膠原酶Ⅱ消化能力稍強，通常用于骨、軟骨以及較硬 / 致密的腫瘤等致密組織；膠原酶IV相比于膠原酶Ⅰ消化作用稍微溫和一些。以分離肝臟腫瘤組織細胞為例，膠原酶Ⅱ能夠有效地消化肝臟中的纖維組織和腫瘤細胞間質，使腫瘤細胞與周圍組織分離，同時對腫瘤細胞的損傷較小。此外，鈣鎂離子和血清不會對膠原酶的活性及消化作用產(chǎn)生影響，這使得膠原酶在處理纖維性組織和癌組織細胞時具有很大的優(yōu)勢。

（三）難消化細胞

對于難消化的細胞，需根據(jù)具體情況選擇含 EDTA 的胰酶或其他組合酶。對于難消化的細胞，如 HCT15、LS411 和 KM12 等，用不含 Ca²⁺和Mg²⁺的 PBS 洗滌一次后，加入稍微多一點含 EDTA 的胰酶，置 37ºC 徹底消化（一般為幾分鐘）至脫落，然后再加培養(yǎng)基終止胰酶反應、離心。這是因為 EDTA 通過螯合 Ca²⁺，抑制 Integrin 的貼壁活性，作用更加溫和。對于一些特別難消化的細胞，還可以考慮使用胰酶/EDTA 聯(lián)合其他酶的方法。例如，在處理某些纖維性組織中的難消化細胞時，可以將胰酶 / EDTA 與膠原酶聯(lián)合使用，增強消化效果。實驗數(shù)據(jù)顯示，對于特定的難消化細胞，采用合適的組合酶進行消化，能夠顯著提高細胞的分離效率，減少消化時間，降低對細胞的損傷。

（四）珍貴細胞

對于原代細胞、干細胞等異常珍貴，且難培養(yǎng)的細胞，一般選擇較為溫和的胰酶類似物，消化更溫和細胞毒性更低，且無需胰酶抑制劑進行中和，更加安全；對于像iPSC等難培養(yǎng)細胞，一般選擇Accutase這類復合酶，更加特異性進行消化。

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