小核酸藥物是目前發(fā)展最為迅速的基因療法之一，作用機理是直接靶向致病靶基因或RNA片段，通常采用固相亞磷酰胺化學(xué)法來進行合成，一般是由12~30個核苷酸單鏈或雙鏈組成的一類藥物，通過直接靶向致病靶基因或作用于信使 RNA(mRNA) 來調(diào)控致病基因轉(zhuǎn)錄翻譯，具有高特異性。

受限于合成效率以及原料質(zhì)量，并不是所有的寡核苷酸都能合成完整的寡核苷酸鏈，合成得到的初產(chǎn)物會含有多種不同的雜質(zhì)，其中最主要的雜質(zhì)就是由于單個或多個寡核苷酸差異導(dǎo)致的失敗序列（N-x/N+x）。這些N-x與N+x雜質(zhì)的性質(zhì)與目標產(chǎn)物非常接近，在分子大小、電荷和疏水性方面的差異通常很小，為純化工藝帶來很大的挑戰(zhàn)，合成后必須應(yīng)用高分辨率純化技術(shù)，才能使目標分子與雜質(zhì)分離。

所以寡核苷酸合成之后，如何選擇合適的填料和純化工藝對于產(chǎn)品質(zhì)量和生產(chǎn)放大都非常重要。目前主流的純化方式主要是陰離子交換層析、反相層析和疏水層析。由于核苷酸序列不同和粗品雜質(zhì)含量的差異，可結(jié)合或選擇其中一種或者兩種方式進行純化。

寡核苷酸藥物通常指由化學(xué)合成的12~30個核苷酸單鏈或雙鏈組成的一類藥物，主要包括反義寡核苷酸 （ASO) 、小干擾RNA（siRNA）、微小RNA（miRNA）、小激活RNA (saRNA)、信使RNA (mRNA)、RNA適配體(Aptamer)等。

寡核苷酸藥物與蛋白類和小分子藥物不同之處在于，寡核苷酸藥物并非作用于蛋白，而是可以直接調(diào)控基因的表達，因此被認為是繼小分子藥物、蛋白藥物之后的第三代創(chuàng)新藥物。

寡核苷酸的合成方法目前主要有液相合成、固相合成以及生物合成的方法。其中最主流的合成方法是采用固相合成法，利用自動化的設(shè)備通過固相亞磷酰胺化學(xué)法來進行合成。

Fig.1所示為合成用單體，主要由堿基、脫氧核糖、5'-DMT和3'端的2-氰乙基以及二異丙胺基組成，而RNA的亞磷酰胺單體中則需要對2'-OH進行保護，以防止在固相合成中2'-OH與5'-OH發(fā)生交叉反應(yīng)，該保護基團一般為TBDMS。

此外，由于腺嘌呤、胞嘧啶和鳥嘌呤和一些人工堿基存在伯氨基，因此也需要在單元中用適當?shù)谋Ｗo基團對其保護。

Fig.1 DNA的亞磷酰胺單體

寡核苷酸的固相合成具體過程由4步循環(huán)組成：脫保護、 偶聯(lián)、氧化和蓋帽。在合成循環(huán)后，需要對中間產(chǎn)品使用氨水進行氨解反應(yīng)，將寡核苷酸從固相載體上切割下來并進行基團的脫保護處理。

Fig.2 寡核苷酸合成流程示意圖

使用干燥有機溶劑與酸液（二氯乙酸）除去核苷酸上的5'-DMT保護基團，暴露5'-OH，以供下一步偶聯(lián)。

單體經(jīng)過活化后被泵入合成柱，脫保護的5'-OH會與亞磷酰胺四唑活性中間體，形成新的磷氧鍵，在這一步核苷酸鏈得到延伸。

偶聯(lián)反應(yīng)生成的亞磷酯鍵，易被酸、堿水解，因此需要進行氧化或硫化操作，形成磷酸二酯（或硫代膦酸二酯）鍵。

為了防止這些5'的活躍基團與下一個循環(huán)加入的活化亞磷酰胺單體發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，進而產(chǎn)生N-1雜質(zhì)，需要對未參與偶聯(lián)的5'-OH羥基加帽。

受限于反應(yīng)效率及原料純度等，合成的產(chǎn)物中存在多種不同的雜質(zhì)。主要表現(xiàn)為單個或多個寡核苷酸的差異（N-x/N+x），保護基團的保留，例如DMT+、3'+產(chǎn)物，以及嘌呤的脫除等。這些基團或者序列的改變會導(dǎo)致雜質(zhì)分子與目標產(chǎn)物之間存在性質(zhì)上的差異。主要表現(xiàn)為：

• 磷酸基團（Phosphate group）：寡核苷酸所帶靜電荷取決于磷酸或修飾基團的數(shù)目、堿基的數(shù)目以及二級結(jié)構(gòu)是否遮蔽帶電基團。通常在變性條件（例pH12）打開氫鍵使結(jié)構(gòu)展開并且堿基不帶電（pH>pKa），以有效區(qū)分N-1雜質(zhì)。

• DMT on/off：DMT是一個強疏水性基團，與反相層析/疏水層析產(chǎn)生相互作用。因此可以用于帶有DMT的全長序列的分離。

• 硫代（Thiolation）：當磷酸基團中的氧原子被硫原子取代時，帶負電的基團極性增加，在大多數(shù)pH條件下與陰離子交換填料結(jié)合更強。

• 甲基化（Methylation）：當氧原子被甲基取代時，疏水增強。

因此，在小核酸的純化過程中可以利用上述性質(zhì)差異進行分離，通常采用離子交換層析、疏水層析及反相層析并進行合理組合。

陰離子層析是一種可以在水相條件下對寡核苷酸進行分離的層析方法，無需使用有機溶劑，因此無需考慮車間和設(shè)備的防爆。

博格隆BestPoly 15Q是一款聚苯乙烯-二乙烯基苯材質(zhì)的強陰離子填料，平均粒徑15μm，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、剛性強，可在高pH條件下操作，高pH可以避免單鏈自互補或者富含GC寡核苷酸聚集。本案例使用博格隆BestPoly 15Q對合成后的寡核苷酸進行純化，最終純度90%以上樣品占比可達52%。

Fig.3 BestPoly 15Q純化寡核苷酸

小核酸藥物作為一個新的生物制藥技術(shù)平臺，現(xiàn)在已進入成熟階段，即將迎來快速發(fā)展。它已經(jīng)展示出一些顛覆性技術(shù)的特質(zhì)，尤其是可能會改變慢性病的治療理念和策略。這一變化會帶來單克隆抗體式的醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)格局重構(gòu)，今后十年、二十年都是核酸制藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一個重大窗口期。

對于寡核苷酸生產(chǎn)來說，最為重要的因素是寡核苷酸的合成及合成后的純化，所以選擇一款高效純化填料十分重要。博格隆作為國內(nèi)層析填料生產(chǎn)行業(yè)的龍頭企業(yè)，也在不斷推出適配市場需求的新產(chǎn)品，為客戶提供更多樣化的選擇。

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