自身免疫性肝炎（AIH）是一種免疫介導(dǎo)的慢性肝病，由免疫系統(tǒng)攻擊肝細胞引起，其特點是血清轉(zhuǎn)氨酶水平升高、IgG水平升高和界面性肝炎。之前的研究發(fā)現(xiàn)，基于利妥昔單抗（CD20抗體）的B細胞清除療法是一種有效策略，適用于對標準療法無應(yīng)答的患者。

這種疾病由T細胞介導(dǎo)，其中抗原激活的CD4+和CD8+ T細胞作為效應(yīng)細胞分化和增殖。B細胞也被認為參與了自身免疫，具體途徑是抗原呈遞、產(chǎn)生自身抗體和細胞因子。然而，確切的分子機制至今仍未闡明，這可能是因為缺乏合適的AIH模型。

日本慶應(yīng)義塾大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究人員近日利用腺相關(guān)病毒（AAV）IL-12模型，再現(xiàn)了自身反應(yīng)性B細胞相關(guān)的AIH病理學(xué)的重要特征。他們成功鑒定了脾臟B細胞與細胞毒性CD8+ T細胞之間的相互作用。這項研究成果發(fā)表在《JHEP Reports》雜志上。
 

圖片來源：《JHEP Reports》
（https://doi.org/10.1016/j.jhepr.2023.100757）

研究材料與方法
在這項研究中，研究人員在賽業(yè)生物的協(xié)助下構(gòu)建了實驗性AIH模型，通過AAV載體在肝臟中過表達IL-12觸發(fā)細胞毒性T細胞的擴增，重現(xiàn)AIH患者的臨床特征。他們利用CD20抗體和B細胞過繼轉(zhuǎn)移驗證了脾臟B細胞的致病作用，并通過RNA測序分析發(fā)現(xiàn)了IL-15的表達上調(diào)。他們還通過流式細胞術(shù)等分析確認了脾臟B細胞與細胞毒性T細胞之間的相互作用。

技術(shù)路線
01 構(gòu)建實驗性AIH模型，利用CD20抗體和過繼轉(zhuǎn)移分析脾臟B細胞的作用
02 通過RNA測序分析發(fā)現(xiàn)B細胞中的IL-15表達上調(diào)，并驗證肝炎發(fā)展是否依賴于IL-15
03 分析脾臟B細胞與CD8+ T細胞之間的相互作用及背后的分子機制
04 利用AIH患者的樣本驗證以上結(jié)果，以探索其轉(zhuǎn)化潛力

研究結(jié)果
1 實驗性AIH模型的構(gòu)建
研究人員構(gòu)建了pAAV IL-12質(zhì)粒載體，并進行了AAV病毒包裝，然后他們將AAV IL-12注射到小鼠體內(nèi)，并觀察給藥1-8周后的病理變化，以確定實驗性AIH（eAIH）模型的適當終點（其中AAV病毒包裝服務(wù)由賽業(yè)生物提供）。他們在4周內(nèi)觀察到血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、IgG、抗核抗體水平升高以及界面性肝炎增加，且ALT和AST（谷草轉(zhuǎn)氨酶）在4周時達到峰值。因此，他們在第4周開展了病理學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟和脾臟中CD4+ T細胞和CD8+ T細胞的數(shù)量增加，其他特征也與AIH患者一致。這些結(jié)果表明，AAV IL-12模型適用于探索AIH病理學(xué)中的相關(guān)機制。

2 B細胞通過擴增CD8+ T細胞加重了eAIH
以往的研究顯示，利用CD20抗體清除B細胞對難治性AIH患者有效果。于是，研究人員也在AAV IL-12模型中研究了CD20抗體對肝炎的療效。CD20抗體治療導(dǎo)致肝臟和脾臟中的B細胞減少，肝炎在部分程度上改善。值得注意的是，他們觀察到血清IgG水平下降。CD20抗體治療降低了記憶性T細胞的數(shù)量，但不影響肝髓系細胞的數(shù)量。這些結(jié)果表明，B細胞在肝炎的發(fā)展過程中起著致病作用。

由于脾臟中的B細胞豐度很高，研究人員推測該器官中的B細胞尤其具有致病作用。為了弄清這一點，他們從注射了AAV IL-12的小鼠脾臟中分離出B細胞，將其過繼轉(zhuǎn)移至脾切除小鼠體內(nèi)（圖1）。雖然脾切除術(shù)降低了ALT水平，但致病性B細胞的過繼轉(zhuǎn)移會逆轉(zhuǎn)這種改善。肝組織學(xué)和肝顆粒酶B+CD8+ T細胞的數(shù)量表現(xiàn)出類似的趨勢，而肝CD4+ T細胞的數(shù)量沒有變化。由此可見，脾臟B細胞通過擴增CD8+ T細胞（CTL）在肝炎的發(fā)展過程中發(fā)揮作用。
 

圖1 致病性B細胞的過繼轉(zhuǎn)移加重了脾切除小鼠的肝炎[1]

3 致病性B細胞中的IL-15表達增加
之后，通過RNA測序分析，研究人員發(fā)現(xiàn)致病性B細胞中IL-15的表達顯著上調(diào)。IL-15是一種眾所周知的細胞因子，促進記憶性CD8+ T細胞和CTL的維持和增殖。因此，他們推測B細胞來源的IL-15在誘導(dǎo)CTL及eAIH的后續(xù)發(fā)展中起關(guān)鍵作用。在小鼠脾臟中，B細胞大約占表達IL-15的免疫細胞的55%。在eAIH小鼠的肝臟/脾臟CD4+和CD8+ T細胞中，IL-15受體的表達升高，表明對IL-15信號傳導(dǎo)更加敏感。此外，他們還觀察到，eAIH小鼠脾臟中的B220+ B細胞和CD8+ T細胞彼此相鄰，這表明它們之間存在直接的相互作用。

為了驗證CTL增殖和肝炎發(fā)展是否依賴于IL-15，他們通過體內(nèi)實驗研究了IL-15中和的效果。與預(yù)期一致，在注射IL-15抗體后，小鼠的血清ALT水平顯著降低，脾細胞數(shù)量減少，而肝臟單核細胞（LMNC）不受影響，表明IL-15抗體對脾臟的作用更強。同樣地，脾臟和肝臟中的總CD8+ T細胞和顆粒酶B+ CD8+ T細胞數(shù)量也減少，表明IL-15中和可抑制脾臟和肝臟CTL，從而改善肝炎。

4 IL-15+ B細胞與CD40L+CD8+ T細胞相互作用
為了驗證B細胞與CD8+ T細胞之間的相互作用，研究人員將來自eAIH小鼠的脾臟CD8+ T細胞與分離自eAIH或?qū)φ招∈蟮钠⑴KB細胞進行共培養(yǎng)。他們發(fā)現(xiàn)，與致病性B細胞的共培養(yǎng)可誘導(dǎo)CD44+CD8+ T細胞的增殖，而對照B細胞則不能（圖2）。值得注意的是，IL-15的中和抑制了CD44+CD8+ T細胞的增殖。這些結(jié)果表明，來源于脾臟B細胞的IL-15促進了記憶性CD8+ T細胞的增殖和維持。

那么，B細胞中的IL-15是如何上調(diào)的？后續(xù)的分析發(fā)現(xiàn)，IFN-γ和CD40抗體的聯(lián)合刺激可上調(diào)小鼠脾臟B細胞中Il15、Cxcl10和Csf1的基因表達，這表明CD40L+細胞在誘導(dǎo)IL-15+ B細胞的過程中發(fā)揮重要作用（圖2）。流式分析表明，eAIH中的脾臟CD8+ T細胞表現(xiàn)出CD40L表達上調(diào)。這些結(jié)果共同表明，脾臟IL-15+ B細胞和CD40L+ CD8+ T細胞相互作用以獲得病理功能。
 

圖2 IL-15+ B細胞與CD40L+CD8+ T細胞相互作用[1]

研究人員假設(shè)，記憶性CD8+ T細胞和CTL在脾臟B細胞誘導(dǎo)下增殖，隨后遷移到肝臟造成肝細胞損傷。他們發(fā)現(xiàn)，在發(fā)炎肝臟的CD8+ T細胞中，趨化因子受體CXCR3的表達明顯增加。CXCR3配體在肝臟中的基因表達也增加，其中Cxcl9的上調(diào)最為顯著。CXCL9的中和可改善eAIH。CXCL9抗體治療明顯降低了肝臟顆粒酶B+ CD8+ T細胞和IL-15Ra+ CXCR3+ CD8+ T細胞的數(shù)量，表明CXCL9/CXCR3軸在肝炎發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。

5 AIH患者血液中的IL-15+ B細胞增加
最后，為了探索這些結(jié)果的轉(zhuǎn)化潛力，研究人員還分析了患者的臨床樣本。他們發(fā)現(xiàn)，AIH患者血清中存在高濃度的IL-15和IL-15+ B細胞，并與ALT水平呈正相關(guān)。此外，他們還觀察到CD40L+IL-15Ra+記憶性T細胞的誘導(dǎo)，表明在AIH患者中存在與IL-15+ B細胞的相互作用。這些結(jié)果支持在AIH患者中進行轉(zhuǎn)化研究和靶向治療。

研究結(jié)論

圖3 脾臟IL-15+ B細胞在AIH發(fā)展中發(fā)揮致病作用[1]

這項研究利用實驗性AIH模型再現(xiàn)了人類AIH的臨床特征。通過這個模型，他們發(fā)現(xiàn)IL-15和CD40L對脾臟中B細胞與CD8+ T細胞之間的相互作用是不可缺少的，這種互作導(dǎo)致CD8+ T細胞局部擴增，并通過CXCL9/CXCR3軸遷移到肝臟，導(dǎo)致AIH發(fā)生。體外和體內(nèi)分析證實了B細胞在AIH中的致病作用（圖3）。研究人員認為，對致病性B細胞的進一步研究有望催生CD20抗體治療之外的新型治療方法。

參考文獻：
[1]Fujimori S, Chu PS, Teratani T, et al. IL-15-producing splenic B cells play pathogenic roles in the development of autoimmune hepatitis. JHEP Rep. 2023 Apr 7;5(7):100757. https://doi.org/10.1016/j.jhepr.2023.100757