當(dāng)我們用動物活體成像系統(tǒng)來檢測構(gòu)建的小鼠腫瘤模型是否成功時，通常會遇到一個問題，那就是用GFP報告基因標(biāo)記的腫瘤細胞在顯微鏡下雖然能檢測到強發(fā)光信號，但是一旦注射進體內(nèi)后，雖然也能檢測到信號，但是背景扣除后就沒有有效信號（圖1），這是為什么呢？

要回答這個問題，我們首先要明白活體成像的成像原理。

小動物活體成像是通過一定的方式對研究對象進行光學(xué)標(biāo)記，使其具有發(fā)光的性質(zhì)，再通過成像技術(shù)及設(shè)備對光信號進行采集成像。光學(xué)標(biāo)記方式主要采用生物發(fā)光與熒光兩種技術(shù)。

生物發(fā)光成像是用熒光素酶(luciferase)基因標(biāo)記細胞或DNA，利用其產(chǎn)生的蛋白酶與相應(yīng)底物發(fā)生生化反應(yīng)產(chǎn)生生物體內(nèi)的探針光信號；而熒光成像則是采用熒光報告基因（如GFP、RFP）或Cyt及dyes等熒光染料進行標(biāo)記，利用熒光蛋白或染料產(chǎn)生的熒光就可以形成體內(nèi)的熒光光源。

那么什么情況下選擇生物發(fā)光？什么情況下選擇熒光成像？本文將為大家作出解答。

生物發(fā)光

生物發(fā)光現(xiàn)象在螢火蟲（圖2）、部分水母等物種中較為常見，這是一種自發(fā)光現(xiàn)象，無需外源激發(fā)光的照射，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，這種自發(fā)光現(xiàn)象是由于特定的酶促反應(yīng)引起的，比如熒光素酶和底物熒光素之間的化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致熒光素被氧化而發(fā)光（圖3）。
 

圖2                                                                  圖3熒光酶素和熒光素的酶促應(yīng)

根據(jù)這一原理，科學(xué)家先通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)把熒光素酶報告基因?qū)�入腫瘤細胞，接著把腫瘤細胞注射進動物體內(nèi)，一段時間以后再注射熒光素，由于熒光素容易擴散進入腫瘤細胞，因此會被氧化發(fā)光，從而通過檢測光信號就能實現(xiàn)對腫瘤細胞的跟蹤。

在一定范圍內(nèi)，發(fā)光強度與被標(biāo)記的細胞數(shù)量正相關(guān)，通過對發(fā)光信號的定量，可以反應(yīng)腫瘤組織的變化情況�；铙w成像系統(tǒng)依靠高靈敏度的相機，可以捕捉這種微弱的生物發(fā)光信號。因為哺乳動物體內(nèi)不會有熒光素酶報告基因的存在，因此這種檢測方法的優(yōu)勢是特異性好，無背景信號干擾。缺陷是應(yīng)用范圍較窄，只能夠用于標(biāo)記細胞。

熒光成像

當(dāng)熒光物質(zhì)被特定波長的激發(fā)光照射后會吸收能量轉(zhuǎn)變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)并不穩(wěn)定，會發(fā)出另一種波長的光來釋放能量，而活體成像系統(tǒng)就是通過捕捉另一種波長的光信號來檢測熒光物質(zhì)的存在（圖4），并且光信號的強度在一定的范圍內(nèi)與熒光物質(zhì)的量成線性關(guān)系。

圖4  熒光物質(zhì)受激發(fā)后發(fā)光的原理

因此熒光信號的采集需要額外的激發(fā)光源，并且在相機鏡頭前還要加裝一塊發(fā)射光濾光片。每個熒光通道的組成都包括激發(fā)光源+發(fā)射光濾光片。

熒光成像的優(yōu)點是應(yīng)用范圍廣，不僅可以標(biāo)記細胞，還可以標(biāo)記藥物、納米載體等。

缺點主要有以下2個方面：

1、某些熒光物質(zhì)的發(fā)射波長較短，容易被吸收，導(dǎo)致穿透性差，體內(nèi)成像效果差。比如GFP綠色熒光蛋白的發(fā)射光中心波長在510nm左右，容易被血紅蛋白或其他生物組織吸收，導(dǎo)致成像效果差。

2、許多動物組織（例如毛發(fā)、腸道、血管等）受激發(fā)光照射后，也會發(fā)出500-600nm左右的發(fā)射光，這就跟GFP、FITC這類熒光物質(zhì)的發(fā)射光接近，造成成像的背景信號較高，信噪比低，不容易區(qū)分有效信號和背景信號。常見生物組織的發(fā)射光波長信息請見圖5。

圖5  常見生物組織的發(fā)射光波長

通常的解決辦法是選擇發(fā)射波長較高的熒光物質(zhì)（發(fā)射波長>700nm）進行體內(nèi)成像，例如DiR、ICG、CY7等。不同發(fā)射波長的信號采集效果差異請見圖6。

圖6  不同發(fā)射波長信號采集的差異

案例回顧

讓我們回到本文開頭的案例，當(dāng)我們改用熒光素酶來標(biāo)記腫瘤細胞后，就能很輕松的采集到發(fā)光信號，幾乎沒有背景信號，清晰可見腫瘤細胞的發(fā)光部位（圖7），可見選對發(fā)光體系的重要性。

圖7

綜上所述，當(dāng)我們構(gòu)建小鼠發(fā)光模型時，優(yōu)先選擇構(gòu)建生物發(fā)光模型。如果標(biāo)記物不是細胞，優(yōu)先選擇發(fā)射波長較高的熒光物質(zhì)（發(fā)射波長>700nm）進行模型構(gòu)建，比如ICG、CY7等，也可以得到理想的結(jié)果（圖8）。

圖8  ICG體內(nèi)成像（右為對照）

結(jié)論

總之，生物發(fā)光和熒光技術(shù)，如何互為補充，取長補短，分別滿足不同的研究領(lǐng)域，將來的發(fā)展方向是兩種技術(shù)并重。對于不同的研究，可根據(jù)兩者的特點以及實驗要求，選擇合適的方法（參考下表）。