期刊：Nat Commun
影響因子：14.7
主要技術(shù)：mRNA-seq、華大C4

導(dǎo)語
干擾素(IFN)治療慢性乙型肝炎病毒(HBV)的潛在機制，特別是在低HBsAg和/或年輕患者中，由于缺乏替代治療方法，目前仍未得到解決。通過CRISPR/ cas9敲入策略，研究了干擾素受體人源化小鼠(huIFNAR小鼠)的基因表達。證明了人類IFN刺激huIFNAR的PBMCs中的基因表達譜與人類PBMCs中的基因表達譜相似，支持了該小鼠模型在體內(nèi)功能分析人類IFN的代表性。揭示了響應(yīng)人類IFN治療的多器官組織特異性基因表達圖譜；這種模式尚未在健康人體中報道。最后，通過AAV-HBV模型測試人干擾素的抗病毒作用。PEG-IFNα2治療15周可顯著降低HBsAg和HBeAg，甚至實現(xiàn)HBsAg血清轉(zhuǎn)化。人干擾素對CD8T細胞的激活可能是抑制HBsAg的關(guān)鍵。huIFNAR小鼠能夠真實地響應(yīng)人干擾素刺激，為研究干擾素在體內(nèi)的功能提供了平臺。PEG-IFNα2治療成功抑制肝內(nèi)HBV復(fù)制，并實現(xiàn)HBsAg血清轉(zhuǎn)化。

技術(shù)服務(wù)
mRNA-seq、華大C4

研究結(jié)果
1. 人源I型干擾素受體小鼠模型的建立
為了研究人類IFN在小鼠中的作用，設(shè)計了一個由人類IFNAR2和IFNAR1組成的串聯(lián)表達盒，它們由一個2A序列連接，并將其置于小鼠IFNAR2啟動子的控制下表達。這兩種小鼠IFNAR1和IFNAR2基因的距離分別位于16號染色體上（僅130kb），避免了連續(xù)兩輪的基因操作，節(jié)省了時間。對于小鼠Ifnar2基因，在ATG起始密碼子旁邊的第2外顯子中插入一個外源序列，不僅使啟動子活性不受干擾，而且在第1外顯子和第2外顯子之間保留了一個完整的內(nèi)含子，增加了新mRNA的穩(wěn)定性。在3‘端有一個polyA信號序列，提供了一個轉(zhuǎn)錄停止信號，并導(dǎo)致小鼠IFNAR2的表達中止。這個設(shè)計保持了插入的人IFNAR1和IFNAR2基因的表達，同時導(dǎo)致小鼠IFNAR缺陷

在嵌合的huIFNAR中，既可以對人的IFNα刺激作出反應(yīng)，又可以保證結(jié)合蛋白的募集和下游通路的激活。通過逆轉(zhuǎn)錄PCR證實了huIFNAR mRNA的表達。流式檢測細胞表面huIFNAR2蛋白的正常表達。最后，在體內(nèi)和體外測試huIFNAR小鼠是否對人I型干擾素注射有反應(yīng)。人IFNα2處理導(dǎo)致小鼠Mx1（mMx1）和小鼠Isg15（mIsg15）mRNA水平上調(diào)。然而，當huIFNAR被抗hR1和/或抗hR2抗體阻斷時，這種激活作用減弱，這意味著huIFNα2誘導(dǎo)的mMx1和mIsg15表達的增加是由人源化的I型IFN受體介導(dǎo)的。為檢測huIFNAR小鼠在體內(nèi)的反應(yīng)，腹腔注射人PEG-IFNα2。在huIFNAR小鼠的PBMCs、肝臟和脾臟中觀察到mMx1和mIsg15 mRNA水平顯著升高，進一步證實了huIFNAR小鼠已成功構(gòu)建，并對人干擾素刺激有反應(yīng)。通過WB檢測脾臟組織中mISG15的表達。與小鼠IFNα5相比，人PEG-IFNα2誘導(dǎo)的mISG15蛋白水平顯著升高。綜上，作者成功地生成了功能性I型干擾素受體人源化小鼠。
 

Fig 1. I型干擾素受體人源化(huIFNAR)小鼠的產(chǎn)生和功能評價

2. Peg-IFNα2刺激huIFNAR小鼠PBMCs中的免疫反應(yīng)與人類PBMCs中類似
使用mRNA測序比較了小鼠PBMCs和人類PBMCs中受刺激的基因表達譜。與模擬處理相比，487個ISG中有199個有顯著變化。利用每個huIFNAR PBMCs和人類PBMCs的前5000個DEGs進行KEGG富集分析。PEG-IFNα刺激了huIFNAR PBMCs中109條KEGG通路富集和人PBMCs中146 最顯著富集的BP非常相似。與免疫系統(tǒng)過程和代謝相關(guān)的變化進一步證實了這種相似性。人Peg-IFNα2誘導(dǎo)的huIFNAR小鼠與人PBMCs的基因反應(yīng)高度相似，表明huIFNAR小鼠可以作為探索人I型干擾素在體內(nèi)功能的替代模型。
 

Fig 2. 小鼠huIFNAR與人PBMCs對人IFN刺激反應(yīng)的相似性分析

3. 人類IFNα2的組織特異性應(yīng)答圖譜
選擇了9個主要組織（腦、血、肺、心、肝、脾、腎、肌肉和腸）來消除體內(nèi)對人PEGIFNα2刺激的組織特異性反應(yīng)。在不同的組織間觀察到huIFNAR mRNA水平的不同。血液、肝臟和脾臟的huIFNAR表達水平最高，肌肉、腸道和大腦的表達水平最低。因此，不同組織對IFNα2的反應(yīng)有很大差別。血液、肝臟和脾臟在PEGIFNα2刺激下表現(xiàn)出最明顯的圖譜變化。心臟、大腦和腸道的反應(yīng)較微弱。分級聚類顯示，與血液相比，肝臟中的一個小基因簇顯著上調(diào)。與肝臟相比，血液中的另一個基因簇下調(diào)。對前50個ISG的變化進行了分析，發(fā)現(xiàn)組織之間在數(shù)量和大小上存在顯著差異，突出表明每個組織對干擾素都有獨特的敏感性。在體內(nèi)全面的組織特異性基因表達圖譜揭示了對人類IFNα2刺激反應(yīng)的功能差異性。
 

Fig 3. 響應(yīng)人PEGIFNα2的組織特異性轉(zhuǎn)錄組圖譜

4. 人Peg-IFNα2治療降低了HuIFNAR小鼠中的HBsAg水平
選擇了一個包含1.3倍HBV基因組（AAV-1.3XHBV）的腺相關(guān)病毒載體，以保證HBV在小鼠中長期存在。在PEG-IFNα2治療前6周，通過尾靜脈注射AAV-1.3×HBV。野生型C57BL/6J作為PEG-IFNα2治療對照。每周檢測病毒HBsAg、HBeAg和HBV DNA。與野生型小鼠相比，HBV生物標志物如HBsAg和HBeAg在早期時間點存在差異。與預(yù)期的一樣，PEG-IFNα2在C57BL/6J小鼠中未能抑制HBV。相比之下，IFNα治療組的HBsAg從第7周開始開始下降。從第10周到終止治療，當每周使用兩次PEG-IFNα2時，并沒有觀察到進一步的下降。在終止時，PEG-IFNα2中的平均血清HBsAg水平約為模擬小鼠的8.04倍。同樣，HBeAg從第9周開始下降，但在終止時僅下降了2.15倍。一只經(jīng)PEG-IFNα2處理的huIFNAR小鼠獲得了HBsAg和HBeAg的丟失，而另一只經(jīng)處理的huIFNAR小鼠在接受PEG-IFNα2治療后，HBsAg顯著減少。在PEG-IFNα2組的6只小鼠中有2只中檢測到HBsAb。PEG-IFNα2降低肝內(nèi)病毒pgRNA和總mRNA，在#3小鼠中幾乎完全抑制。肝內(nèi)病毒rcDNA結(jié)果顯示，huIFNAR模型中的HBV rcDNA水平比野生型C57BL/6J AAV-HBV模型低一半。
 

Fig 4. 人PEG-IFNα2在huIFNAR AAV-HBV小鼠模型中抑制HBV

5. PEG-IFNα2治療15周后肝內(nèi)免疫細胞群的改變
對8856個細胞的基因表達數(shù)據(jù)進行聚類分析，揭示了8個主要不同的細胞類型。PEG-IFNα2治療顯示出增加髓系和中性粒細胞數(shù)量的趨勢，并減少NK/T和B細胞數(shù)量。與模擬小鼠相比，在peg-IFNα2處理的小鼠的單核細胞中，有67個基因表達上調(diào)，16個基因表達下調(diào)。這些差異表達的基因富集于NF-kappaB信號通路、toll樣受體信號通路、細胞凋亡和IL-17信號通路。單核細胞似乎具有促炎的特性。與模擬治療相比，IFNα2使單核細胞敏感，使其對IFN更敏感，增強抗原呈遞，提高共刺激分子表達，對免疫細胞更有吸引力，以及增殖活性。utg1a高的簇更容易對IFN產(chǎn)生反應(yīng)，而MHCI高的簇顯示出更高的抗原呈遞評分。trem1高的簇似乎對IFN的反應(yīng)較弱，趨化因子促炎癥和增殖的得分較高。流式分析顯示，經(jīng)PEG-IFNα2治療后，肝臟中MHCII+ Ly6C+單核細胞和促炎巨噬細胞顯著增加。
 

Fig 5. 單細胞水平干擾素治療15周后肝內(nèi)單核細胞的特征


Fig 6. 肝內(nèi)單核細胞和巨噬細胞的流式分析

與模擬小鼠相比，NK和NKT細胞在PEG-IFNα2處理的小鼠中的數(shù)量略有減少，但肝臟常駐NK細胞的數(shù)量顯著減少。T細胞在肝臟中富集，但CD4水平不受影響。PEGIFNα2處理組的CD8+ T細胞顯示出白細胞粘附、激活和T細胞受體信號傳導(dǎo)等功能上調(diào)。整個CD8+細胞在活化、趨化因子、細胞毒性和衰竭方面的得分較高。Lef1+CD8t細胞數(shù)量明顯減少，而TeffCD8t細胞數(shù)量明顯激。肝內(nèi)Teff CD8 T細胞表現(xiàn)出活化功能、細胞毒性功能和趨化性功能的增強。Teff CD8 T細胞也失調(diào)了耗盡特異性基因的表達，并表現(xiàn)出耗盡的基因表達譜，表明這些細胞群的效應(yīng)功能包括衰竭分子的上調(diào)。流式分析還顯示，效應(yīng)記憶CD8+ T（TEM）細胞顯著增加，CD8+ TEM和總CD8 T細胞均表達PD-1水平升高。使用酶聯(lián)免疫吸附點（ELISpot）試驗分析了HBV特異性T細胞的免疫反應(yīng)。用HBV和HBsAg刺激肝內(nèi)淋巴細胞。測定分泌的小鼠IFN-γ。但沒有觀察到HBV特異性T細胞。總之，在效應(yīng)CD8T細胞中，衰竭生物標志物的共同表達可能會降低這些細胞在體內(nèi)抑制HBV的效力。
 

Fig 7. 單細胞水平干擾素治療15周后肝內(nèi)CD8+ T細胞的特征


Fig 8. 肝內(nèi)CD8+ T細胞的流式分析

參考文獻：
Wang Y, Guo L, Shi J, Li J, Wen Y, Gu G, Cui J, Feng C, Jiang M, Fan Q, Tang J, Chen S, Zhang J, Zheng X, Pan M, Li X, Sun Y, Zhang Z, Li X, Hu F, Zhang L, Tang X, Li F. Interferon stimulated immune profile changes in a humanized mouse model of HBV infection. Nat Commun. 2023 Nov 15;14(1):7393. doi: 10.1038/s41467-023-43078-5IF: 14.7 Q1 . PMID: 37968364; PMCID: PMC10652013.