不同時期小鼠心肌細胞的分離方法
研究背景：
原代心肌細胞(CMs)是體外心臟生理和病理生理研究的寶貴材料。原代小鼠心肌細胞在不同發(fā)育階段心肌細胞的增殖、凋亡、電生理、細胞內(nèi)鈣通量、收縮力學(xué)和蛋白質(zhì)表達均有不同。分離不同階段、獲得活性較好的CMs最佳方法仍存在一些問題。
中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院、北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院國家心血管病中心阜外醫(yī)院心血管病國家重點實驗室聶宇教授團隊在《Journal of Molecular and Cellular Cardiology》上發(fā)表了題為“Methods of mouse cardiomyocyte isolation from postnatal heart”的文章。文章優(yōu)化了小鼠從胚胎期到成年期分離高質(zhì)量CMs的方案，為心血管疾病的機制、病理和藥理學(xué)研究提供了支持。
圖1 E14.5小鼠CMs的分離
(1)麻醉P1小鼠，取心臟。
(2)在PBS中去除心房，將心室放入C-tube中，使用新生期心臟分離試劑盒。
注:心室未被剪成小塊。每2.5 mL酶混合物可處理多達20個的新生小鼠心臟。當(dāng)處理更多的心臟時，所有的試劑體積相應(yīng)增加。
(3)將C-tube中的心室置于Gentle MACS Octo解離器中，使用37°C_mr_NHDK的程序進行消化。消化時間約為56分鐘。
(4)如果沒有Gentle MACS™解離器，新生期心臟可以用新生期心臟解離試劑盒，37°C水浴分離，每15-20分鐘輕彈三次。
(5)結(jié)束時，立即加入含10% FBS的DMEM，終止消化。
注意:在分離結(jié)束時，使用含有10% FBS的預(yù)熱DMEM立即終止消化，以避免過度消化導(dǎo)致CMs活力和產(chǎn)量降低。
(6)用100 μm濾網(wǎng)過濾細胞懸液，300 ×g，離心5 min，小心吸取上清液。
注:每次離心后，輕拍CMs，使細胞分散。避免劇烈的渦旋和移液對CMs的損害。
(7) 加入紅細胞溶解液，去除紅細胞。孵育3-5分鐘后，300 ×g，離心5分鐘。小心吸取上清液。
(8) 將含CMs和非CMs的細胞沉淀物用PBS洗滌一次，然后用含10% FBS的DMEM重懸。
(9) 采用梯度沉降法分離CMs。將心肌細胞置于含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)皿中，37℃，5% CO2，培養(yǎng)90 min，去除附著的非CMs，收獲主要含有CMs的細胞懸液。
2.2.2 P1 CMs的活力、產(chǎn)量、形態(tài)、純度和大小
使用Gentle MACS方法，每顆心臟產(chǎn)生約4.2 × 105 CMs，平均存活率為96%。培養(yǎng)24 h后，CMs伸展良好，呈現(xiàn)梭形多邊形樣。分離的P1 CM檢測，約84%的細胞為α-actinin+（圖2）。
圖2 P1小鼠CMs的分離
2.3 P4和P7小鼠CMs的分離
Gentle MACS方法分離P4和P7小鼠心臟，然而，獲得的CMs細胞活力較低，桿狀細胞較少。因此，采用另一種方法Langendorff-free perfusion method分離P4和P7小鼠心臟。
2.3.1 采用Langendorff-free法分離P4和P7小鼠CMs
(1)用異氟醚麻醉P4或P7小鼠，固定在解剖平臺上。
(2)切開下腔靜脈和腹主動脈放血。
(3)打開胸腔，充分暴露心臟，將EDTA緩沖液恒速緩慢的注入右心室(RV)頂點。
(4)打開升主動脈，用Lahey鉗夾住。
(5)立即將心臟移入裝有EDTA緩沖液的6 cm培養(yǎng)皿中，將EDTA緩沖液恒速緩慢的注入左心室心尖。
(6)然后將心臟轉(zhuǎn)移到灌注液的6 cm培養(yǎng)皿中，灌注液以恒速緩慢注入左室。
注:在整個心臟灌注步驟中，使用加熱毯保持溫度在37℃，以獲得高活力的高數(shù)量CMs。
(7) 然后將心臟移入含有膠原酶緩沖液（預(yù)熱至37℃）的6 cm培養(yǎng)皿中，將膠原酶緩沖液恒速緩慢注入左室，直至心臟變白變軟。
注:嚴格控制緩沖液的灌注速度，以獲得更多的桿狀CMs。速度過高會導(dǎo)致細胞破裂，桿狀細胞減少。灌注速率約為4-5 mL / min。
(8) 取下鉗，用微型剪剪開心室至1 mm3大小，然后輕輕移液。
(9) 終止緩沖液停止消化，100 μm濾網(wǎng)過濾細胞懸液。
(10) 室溫下，多次自然重力沉降(每次20 min)，收集含CMs顆粒。懸浮液中未沉淀的細胞為非CMs細胞，通過300 ×g，離心5 min，可收集非CMs進行研究。
注:P4和P7小鼠CMs也可以通過低速離心（室溫下，約20 ×g ，3分鐘）沉淀，以獲得高產(chǎn)量的棒狀CMs。
2.3.2 P4和P7 CMs的活力、產(chǎn)量、形態(tài)、純度和大小
P4和P7 CM的桿狀細胞存活率分別高達84%和75%。CM產(chǎn)率分別為每顆心臟7.2(±0.2)× 105 和8.2(±0.4)× 105 CMs，表現(xiàn)出典型的CM形態(tài)結(jié)構(gòu)，肌絲排列有序，CM的純度大概達到80%（圖3）。P4和P7 CMs的長度分別為58.7±10.7 μm和69.3±9.0 μm，寬度分別為12.4±5.8 μm和12.5±2.9 μm。
圖3 P4和P7小鼠CMs的分離
原代心肌細胞(CMs)是體外心臟生理和病理生理研究的寶貴材料。原代小鼠心肌細胞在不同發(fā)育階段心肌細胞的增殖、凋亡、電生理、細胞內(nèi)鈣通量、收縮力學(xué)和蛋白質(zhì)表達均有不同。分離不同階段、獲得活性較好的CMs最佳方法仍存在一些問題。
中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院、北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院國家心血管病中心阜外醫(yī)院心血管病國家重點實驗室聶宇教授團隊在《Journal of Molecular and Cellular Cardiology》上發(fā)表了題為“Methods of mouse cardiomyocyte isolation from postnatal heart”的文章。文章優(yōu)化了小鼠從胚胎期到成年期分離高質(zhì)量CMs的方案，為心血管疾病的機制、病理和藥理學(xué)研究提供了支持。
這項研究中，發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶消化法適用于胚胎小鼠CM的分離。Gentle MACS方法適用于新生心臟CMs的分離（出生后第1- 3天，P1-P3）。Langendorff-free灌注法適用于P3以上小鼠CMs的分離。Langendorff灌注系統(tǒng)可以分離P14和P56 CMs。同時，對不同發(fā)育階段的CMs進行RNA-Seq分析。非CM標(biāo)志物：Pdgfra、Pecam1、aMyh11、Ptprc、Adgre1、Itgal、Cd3g和Cd79a的表達水平極低。此外，Ang II增加了P1和P56 CMs的大小。這證實了分離的CMs的轉(zhuǎn)錄譜和細胞功能，表明了分離方法的可行性和有效性。
分離方法和結(jié)果：
2.1 胚胎期14.5天(E14.5)小鼠CMs的分離與評價
由于組織致密性低，胚胎心臟的分離采用傳統(tǒng)的胰蛋白酶消化。
2.1.1 E14.5小鼠CMs的分離
(1)用異氟醚麻醉孕小鼠，在體視顯微鏡下，取出胚胎心臟。
(2)在磷酸鹽緩沖液(PBS)中去除心房，心室剪至1 mm3大小。
(3)心室用0.25% Trypsin-EDTA，37℃水浴消化，每10-15分鐘輕拍三次，使細胞分散。
注:胰蛋白酶體積由心臟大小和數(shù)量決定。通常500 μL 0.25% Trypsin-EDTA，可解離10個E14.5心臟。
(4) 當(dāng)觀察不到明顯組織時，加入含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，停止消化。
(5) 用100 μm濾網(wǎng)過濾細胞懸液，300 ×g，離心5 min，小心抽吸上清液。
(6) 加入紅細胞溶解液，去除紅細胞。孵育3-5 min后，300 ×g，離心5分鐘，小心抽吸上清液。
(7) 將含CMs和非CMs的細胞沉淀物用PBS洗滌一次，然后用含10% FBS的DMEM重懸。
(8) 采用梯度沉降法分離CMs。將心肌細胞置于含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)皿中，37℃，5% CO2，培養(yǎng)90 min，去除附著的非CMs，收獲主要含有CMs的細胞懸液。
2.1.2 檢測分離得到的E14.5 CMs的活力、產(chǎn)量、形態(tài)，純度和大小
Countstar儀器測定表明，分離的E14.5 CMs具有較高的生存率(> 90%)和產(chǎn)量((2.5±0.2)× 105)。培養(yǎng)24小時后，CMs分布良好，呈梭狀多邊形。E14.5 CMs中α-actinin+細胞的比例為87.67±1.25%（圖1）。培養(yǎng)過夜，α-actinin免疫熒光染色顯示典型的CM形態(tài)結(jié)構(gòu)。E14.5 CMs的長度為37.9±5.2 μm，寬度為12.5±4.0 μm。
這些結(jié)果表明，傳統(tǒng)的胰蛋白酶消化法適用于制備胚胎小鼠CMs，具有較高的存活率、產(chǎn)量和純度。
分離方法和結(jié)果：
2.1 胚胎期14.5天(E14.5)小鼠CMs的分離與評價
由于組織致密性低，胚胎心臟的分離采用傳統(tǒng)的胰蛋白酶消化。
2.1.1 E14.5小鼠CMs的分離
(1)用異氟醚麻醉孕小鼠，在體視顯微鏡下，取出胚胎心臟。
(2)在磷酸鹽緩沖液(PBS)中去除心房，心室剪至1 mm3大小。
(3)心室用0.25% Trypsin-EDTA，37℃水浴消化，每10-15分鐘輕拍三次，使細胞分散。
注:胰蛋白酶體積由心臟大小和數(shù)量決定。通常500 μL 0.25% Trypsin-EDTA，可解離10個E14.5心臟。
(4) 當(dāng)觀察不到明顯組織時，加入含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，停止消化。
(5) 用100 μm濾網(wǎng)過濾細胞懸液，300 ×g，離心5 min，小心抽吸上清液。
(6) 加入紅細胞溶解液，去除紅細胞。孵育3-5 min后，300 ×g，離心5分鐘，小心抽吸上清液。
(7) 將含CMs和非CMs的細胞沉淀物用PBS洗滌一次，然后用含10% FBS的DMEM重懸。
(8) 采用梯度沉降法分離CMs。將心肌細胞置于含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)皿中，37℃，5% CO2，培養(yǎng)90 min，去除附著的非CMs，收獲主要含有CMs的細胞懸液。
2.1.2 檢測分離得到的E14.5 CMs的活力、產(chǎn)量、形態(tài)，純度和大小
Countstar儀器測定表明，分離的E14.5 CMs具有較高的生存率(> 90%)和產(chǎn)量((2.5±0.2)× 105)。培養(yǎng)24小時后，CMs分布良好，呈梭狀多邊形。E14.5 CMs中α-actinin+細胞的比例為87.67±1.25%（圖1）。培養(yǎng)過夜，α-actinin免疫熒光染色顯示典型的CM形態(tài)結(jié)構(gòu)。E14.5 CMs的長度為37.9±5.2 μm，寬度為12.5±4.0 μm。
這些結(jié)果表明，傳統(tǒng)的胰蛋白酶消化法適用于制備胚胎小鼠CMs，具有較高的存活率、產(chǎn)量和純度。
圖1 E14.5小鼠CMs的分離
2.2 出生后第1天(P1)小鼠CMs的分離與評價
新生期心臟分離試劑盒用于從新生小鼠心臟中溫和快速地產(chǎn)生單細胞懸液，結(jié)合Gentle MACS™解離器，獲得高產(chǎn)量的CMs。
(1)麻醉P1小鼠，取心臟。
(2)在PBS中去除心房，將心室放入C-tube中，使用新生期心臟分離試劑盒。
注:心室未被剪成小塊。每2.5 mL酶混合物可處理多達20個的新生小鼠心臟。當(dāng)處理更多的心臟時，所有的試劑體積相應(yīng)增加。
(3)將C-tube中的心室置于Gentle MACS Octo解離器中，使用37°C_mr_NHDK的程序進行消化。消化時間約為56分鐘。
(4)如果沒有Gentle MACS™解離器，新生期心臟可以用新生期心臟解離試劑盒，37°C水浴分離，每15-20分鐘輕彈三次。
(5)結(jié)束時，立即加入含10% FBS的DMEM，終止消化。
注意:在分離結(jié)束時，使用含有10% FBS的預(yù)熱DMEM立即終止消化，以避免過度消化導(dǎo)致CMs活力和產(chǎn)量降低。
(6)用100 μm濾網(wǎng)過濾細胞懸液，300 ×g，離心5 min，小心吸取上清液。
注:每次離心后，輕拍CMs，使細胞分散。避免劇烈的渦旋和移液對CMs的損害。
(7) 加入紅細胞溶解液，去除紅細胞。孵育3-5分鐘后，300 ×g，離心5分鐘。小心吸取上清液。
(8) 將含CMs和非CMs的細胞沉淀物用PBS洗滌一次，然后用含10% FBS的DMEM重懸。
(9) 采用梯度沉降法分離CMs。將心肌細胞置于含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)皿中，37℃，5% CO2，培養(yǎng)90 min，去除附著的非CMs，收獲主要含有CMs的細胞懸液。
2.2.2 P1 CMs的活力、產(chǎn)量、形態(tài)、純度和大小
使用Gentle MACS方法，每顆心臟產(chǎn)生約4.2 × 105 CMs，平均存活率為96%。培養(yǎng)24 h后，CMs伸展良好，呈現(xiàn)梭形多邊形樣。分離的P1 CM檢測，約84%的細胞為α-actinin+（圖2）。
圖2 P1小鼠CMs的分離
2.3 P4和P7小鼠CMs的分離
Gentle MACS方法分離P4和P7小鼠心臟，然而，獲得的CMs細胞活力較低，桿狀細胞較少。因此，采用另一種方法Langendorff-free perfusion method分離P4和P7小鼠心臟。
2.3.1 采用Langendorff-free法分離P4和P7小鼠CMs
(1)用異氟醚麻醉P4或P7小鼠，固定在解剖平臺上。
(2)切開下腔靜脈和腹主動脈放血。
(3)打開胸腔，充分暴露心臟，將EDTA緩沖液恒速緩慢的注入右心室(RV)頂點。
(4)打開升主動脈，用Lahey鉗夾住。
(5)立即將心臟移入裝有EDTA緩沖液的6 cm培養(yǎng)皿中，將EDTA緩沖液恒速緩慢的注入左心室心尖。
(6)然后將心臟轉(zhuǎn)移到灌注液的6 cm培養(yǎng)皿中，灌注液以恒速緩慢注入左室。
注:在整個心臟灌注步驟中，使用加熱毯保持溫度在37℃，以獲得高活力的高數(shù)量CMs。
(7) 然后將心臟移入含有膠原酶緩沖液（預(yù)熱至37℃）的6 cm培養(yǎng)皿中，將膠原酶緩沖液恒速緩慢注入左室，直至心臟變白變軟。
注:嚴格控制緩沖液的灌注速度，以獲得更多的桿狀CMs。速度過高會導(dǎo)致細胞破裂，桿狀細胞減少。灌注速率約為4-5 mL / min。
(8) 取下鉗，用微型剪剪開心室至1 mm3大小，然后輕輕移液。
(9) 終止緩沖液停止消化，100 μm濾網(wǎng)過濾細胞懸液。
(10) 室溫下，多次自然重力沉降(每次20 min)，收集含CMs顆粒。懸浮液中未沉淀的細胞為非CMs細胞，通過300 ×g，離心5 min，可收集非CMs進行研究。
注:P4和P7小鼠CMs也可以通過低速離心（室溫下，約20 ×g ，3分鐘）沉淀，以獲得高產(chǎn)量的棒狀CMs。
2.3.2 P4和P7 CMs的活力、產(chǎn)量、形態(tài)、純度和大小
P4和P7 CM的桿狀細胞存活率分別高達84%和75%。CM產(chǎn)率分別為每顆心臟7.2(±0.2)× 105 和8.2(±0.4)× 105 CMs，表現(xiàn)出典型的CM形態(tài)結(jié)構(gòu)，肌絲排列有序，CM的純度大概達到80%（圖3）。P4和P7 CMs的長度分別為58.7±10.7 μm和69.3±9.0 μm，寬度分別為12.4±5.8 μm和12.5±2.9 μm。
圖3 P4和P7小鼠CMs的分離
2.4 P14和P56小鼠CMs的分離
首先采用了langendorff -free灌注分離P14小鼠心臟，獲得每心臟產(chǎn)生8.8(±0.7)× 105 CMs和82%±2.2% 的活的桿狀CMs。此外，也使用了Langendorff灌注分離成年的CMs。
2.4.1 Langendorff灌注系統(tǒng)分離P14小鼠CMs
(1)用異氟烷麻醉P14小鼠，固定在解剖平臺上。
(2)沿劍突打開胸腔，盡可能清晰地暴露心臟。
(3)然后迅速找到主動脈，用鑷子固定，剪下心臟。將心臟置于預(yù)冷灌注液中，并迅速沖洗。
(4)心臟自然泵出血液后，快速找到主動脈，適當(dāng)切開。
(5)將5 ml注射器針頭插入主動脈口，懸掛心臟。
(6)灌注液灌注心臟3-5 min，灌注速率約為4 - 5 mL / min。
(7)預(yù)熱膠原酶液，消化心臟。心臟在前10分鐘逐漸僵硬、腫脹、變白，然后慢慢軟化。
(8)約30 min后，心臟變白變軟，置于膠原酶緩沖液中。分離心室至1 mm3大小，然后輕輕移液。
(9)終止緩沖液停止消化，100 μm濾網(wǎng)過濾細胞懸液。
(10)室溫下進行多輪自然重力沉降(每次20 min)，收集含CMs顆粒。懸浮液中未沉淀的細胞為非CMs細胞，通過300 ×g，離心5 min，可收集非CMs進行研究。
(1) 分離的P56小鼠CMs進行連續(xù)4輪重力沉降，使用3種復(fù)鈣緩沖液，使鈣濃度逐漸恢復(fù)到生理水平。
(2) 每輪的細胞顆粒都富集了CM，最終得到了高純度的CM顆粒。
(3) 將CMs重懸于預(yù)熱的培養(yǎng)液中，在加濕組織培養(yǎng)箱(37◦C， 5% CO2)中以不同的應(yīng)用密度，種植在預(yù)先涂有l(wèi)aminin(5 μg/mL)的組織培養(yǎng)塑料或玻璃皿上。
(4) 孵育1 h后，將培養(yǎng)液換為新鮮、預(yù)熱的培養(yǎng)基。
(5) 培養(yǎng)CMs用于后續(xù)實驗。培養(yǎng)基每48 h更新一次。
首先采用了langendorff -free灌注分離P14小鼠心臟，獲得每心臟產(chǎn)生8.8(±0.7)× 105 CMs和82%±2.2% 的活的桿狀CMs。此外，也使用了Langendorff灌注分離成年的CMs。
2.4.1 Langendorff灌注系統(tǒng)分離P14小鼠CMs
(1)用異氟烷麻醉P14小鼠，固定在解剖平臺上。
(2)沿劍突打開胸腔，盡可能清晰地暴露心臟。
(3)然后迅速找到主動脈，用鑷子固定，剪下心臟。將心臟置于預(yù)冷灌注液中，并迅速沖洗。
(4)心臟自然泵出血液后，快速找到主動脈，適當(dāng)切開。
(5)將5 ml注射器針頭插入主動脈口，懸掛心臟。
(6)灌注液灌注心臟3-5 min，灌注速率約為4 - 5 mL / min。
(7)預(yù)熱膠原酶液，消化心臟。心臟在前10分鐘逐漸僵硬、腫脹、變白，然后慢慢軟化。
(8)約30 min后，心臟變白變軟，置于膠原酶緩沖液中。分離心室至1 mm3大小，然后輕輕移液。
(9)終止緩沖液停止消化，100 μm濾網(wǎng)過濾細胞懸液。
(10)室溫下進行多輪自然重力沉降(每次20 min)，收集含CMs顆粒。懸浮液中未沉淀的細胞為非CMs細胞，通過300 ×g，離心5 min，可收集非CMs進行研究。
2.4.2 P14 CMs的活力、產(chǎn)量、形態(tài)、純度和大小
該方法每心臟產(chǎn)生8.6(±0.5)× 105 CMs和79%±3.3%的活的桿狀CMs（圖4）。P14 CMs中α-actinin+ DAPI+/DAPI+細胞的比例大于90%，存在大量多核多倍體CMs。P14 CMs的長度為78.6±12.1 μm，寬度為16.5±2.8 μm。
圖4 P14和P56小鼠CMs的分離
2.4.3 P56小鼠CMs的分離
采用Langendorf-free灌注法和Langendorff灌注系統(tǒng)對P56小鼠心臟進行灌注。兩種方法的桿狀CMs百分比相似(> 76%)，每心臟約為9× 105 CMs（圖4）。P56 CMs中α-actinin+ DAPI+/DAPI+細胞的比例約為93%（圖4）。P56 CMs長85.3±16.0 μm，寬27.6±9.9 μm。
(1) 分離的P56小鼠CMs進行連續(xù)4輪重力沉降，使用3種復(fù)鈣緩沖液，使鈣濃度逐漸恢復(fù)到生理水平。
(2) 每輪的細胞顆粒都富集了CM，最終得到了高純度的CM顆粒。
(3) 將CMs重懸于預(yù)熱的培養(yǎng)液中，在加濕組織培養(yǎng)箱(37◦C， 5% CO2)中以不同的應(yīng)用密度，種植在預(yù)先涂有l(wèi)aminin(5 μg/mL)的組織培養(yǎng)塑料或玻璃皿上。
(4) 孵育1 h后，將培養(yǎng)液換為新鮮、預(yù)熱的培養(yǎng)基。
(5) 培養(yǎng)CMs用于后續(xù)實驗。培養(yǎng)基每48 h更新一次。
2.5 分離的CMs的RNA測序
我們對不同發(fā)育階段分離的小鼠CMs進行了RNA測序(RNA- seq)。轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)的主成分分析(PCA)顯示，CM組按發(fā)育階段聚類，包括E14.5、P1、P4、P7、P14和P56階段，每個發(fā)育階段對應(yīng)的3個生物重復(fù)呈現(xiàn)一致的聚類。結(jié)果顯示，在所有分離的CM中，非CM標(biāo)記基因均低表達，包括成纖維細胞標(biāo)記Pdgfra、內(nèi)皮細胞標(biāo)記Pecam1、血管平滑肌細胞標(biāo)記Myh11、白細胞標(biāo)記Ptprc、巨噬細胞標(biāo)記Adgre1、單核細胞標(biāo)記Itgal、T細胞標(biāo)記Cd3g和B細胞標(biāo)記Cd79a（圖5），表明分離的CMs具有較高的純度。
圖5 不同年齡小鼠分離的CMs的RNA序列分析
2.6 血管緊張素II（Ang II）干預(yù)后CM隨時間的活性和細胞功能的評估
使用CCK-8試劑盒測量P1 CMs的活力，在前3-4天CM的活力升高，隨后CM活力逐漸下降。而P56 CM的活力隨著時間的推移逐漸下降。在第4天，大約50%的P56 CMs仍有活力，在第14天幾乎沒有觀察到有活力的CMs(圖6)。
用Ang II處理P1和P56 CM 48小時后，細胞大小均增加。
圖6 血管緊張素II（Ang II）干預(yù)后CM隨時間的活性和細胞功能的評估
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