1. 組織塊的質(zhì)量是否良好？

對于CosMx™ SMI單細(xì)胞空間組學(xué)數(shù)據(jù)來說，組織塊質(zhì)量是其中的一個關(guān)鍵變量。制作高質(zhì)量組織塊的兩個關(guān)鍵因素是固定和缺血時間。

推薦使用10%的NBF或4%的PFA固定蛋白和RNA組織。由于一次理想的組織固定依賴于固定物在組織中的擴(kuò)散是否充分，所以推薦的標(biāo)本厚度為2-3毫米。在這種厚度下，大多數(shù)組織類型在室溫下需要至少24小時的固定時間（最多72小時）。較厚的組織切片和組織類型，如骨、血或脂肪組織、含有艾滋病毒的組織和某些胎兒組織可能需要較長的固定時間。組織固定不足會導(dǎo)致樣品降解和形態(tài)保存不良。過度固定也應(yīng)避免，因?yàn)樗�可能�?dǎo)致非特異性背景染色。標(biāo)本的最佳固定時間往往需要經(jīng)過摸索而得出。

缺血時間是指某一特定器官或組織被剝奪足夠血液供應(yīng)，從而失去氧氣和營養(yǎng)的時間。雖然在小鼠研究中通常比在人體研究中更容易控制，但缺血是防止組織損傷和RNA降解的關(guān)鍵因素之一。缺血時間越短，RNA質(zhì)量越好。

通常，我們使用H&E染色來評估組織塊的質(zhì)量。H&E染色可用于確定組織是否正確固定，以及確認(rèn)組織質(zhì)量差的區(qū)域，例如厚度不一致，撕裂，褶皺和顫動；同時，通過染色圖也能從病理上確認(rèn)目的疾病區(qū)域是否存在，是否符合研究需要。當(dāng)在CosMx™ SMI儀器上運(yùn)行時，此評估還可用于輔助FOV的選擇。

在這里，小編為大家展示幾個H&E染色評估組織塊質(zhì)量的例子：

(1)  用中性緩沖福爾馬林固定的腎臟石蠟切片。

固定良好的組織，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)形態(tài)良好，收縮最小，基底膜和細(xì)胞邊緣清晰。

(2) 用中性緩沖福爾馬林固定的腎臟石蠟切片。

固定不良的組織，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)形態(tài)較差，細(xì)胞邊緣過度收縮，界限不清。

(3) 用中性緩沖福爾馬林固定的小腸粘膜石蠟切片。

細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)保存良好，但存在一些細(xì)胞收縮。

(4) 小腸粘膜石蠟切片，用95%乙醇固定。

雖然核保存良好，但細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外成分大量萎縮。

一些組織處理或切片質(zhì)量差的例子：

2.  組織切片質(zhì)量是否良好？

下游試驗(yàn)的成功完成取決于切片和載玻片制備過程中的技術(shù)。切片的粘附性和厚度的一致性對下游分析性能有影響。在切片這一環(huán)節(jié)，SBC空間生物學(xué)小分隊的伙伴們技術(shù)嫻熟，經(jīng)驗(yàn)豐富，若您想要開展單細(xì)胞空間組學(xué)研究，可以放心地將樣本交給我們！

下圖展示了高質(zhì)量和低質(zhì)量FFPE切片之間的區(qū)別。

3. 是否考慮到組織異質(zhì)性和自體熒光的問題？

如前所述，我們建議在CosMx™ SMI實(shí)驗(yàn)正式開始之前用連續(xù)切片進(jìn)行H&E染色。該連續(xù)切片既可用于評估組織塊質(zhì)量，也可用于指導(dǎo)FOV圈選。通過恰當(dāng)?shù)腇OV選擇，可以避免選擇低質(zhì)量的組織區(qū)域，聚焦核心研究區(qū)域，并減少儀器的運(yùn)行時間。

選擇組織區(qū)域時要考慮科學(xué)問題。例如，下圖的研究重點(diǎn)是研究癌癥、肌肉和正常組織，而不是結(jié)締組織。FOV所在區(qū)域是為了回答研究中的科學(xué)問題。左圖顯示了H&E切片，用于指導(dǎo)使用CosMx™ SMI 1K RNA檢測運(yùn)行的FOV的選擇。同樣覆蓋在右邊圖像上的是每個視場的RNA表達(dá)計數(shù)。RNA檢出隨著組織形態(tài)變化而變化。在結(jié)締組織、脂肪組織和粘液中通常觀察到較低的RNA檢出。

盡可能避免將FOV定在組織壞死、剝落、褶皺、皺紋和撕裂處。

組織自身熒光是另一個需要考慮的變量。高的組織自身熒光可能導(dǎo)致更高的背景，并影響細(xì)胞分割。在運(yùn)行期間需要通過選擇正確的預(yù)漂白來最大限度地減少自身熒光并提高數(shù)據(jù)質(zhì)量。

SBC先后搭建GeoMx® DSP和CosMx™ SMI兩大空間組學(xué)研究平臺，并與NanoString攜手共建DSP空間組學(xué)“卓越中心”，搭配10x Visium Cytassist以及LCM+timsTOF Pro 4D非靶向深度空間蛋白組平臺，打造空間生物學(xué)全鏈條創(chuàng)新多組學(xué)平臺及解決方案，助力科學(xué)發(fā)現(xiàn)。