ELISA雙抗體夾心法的原理和步驟介紹
酶聯(lián)接免疫吸附測定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ），簡稱ELISA，是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原抗體的特異性反應(yīng)與酶對底物的高效催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的實驗技術(shù)。
1.原理：
免疫分析是一種利用特定抗體與抗原或半抗原發(fā)生的高選擇性高特異性識別和結(jié)合原理，對待測抗體或者抗原進(jìn)行分析測定的方法，酶聯(lián)免疫吸附分析（下稱ELISA）是免疫分析的一種，分三個部分組成：免疫識別，信號輸出和數(shù)據(jù)處理。
2.步驟：
免疫識別是在聚苯乙烯制成的96孔板上包被抗體，而后利用抗體識別待測的抗原（通常是疾病的蛋白質(zhì)生物標(biāo)記物，病毒，細(xì)菌等等，從復(fù)雜待測液中將抗原吸附到96孔板表面。接著用帶有辣根過氧化酶（Horseradish Peroxidase, HRP）、熒光或放射性標(biāo)記的抗體通過直接或者間接的方式輸出識別信號。最后利用信號強(qiáng)度，標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度梯度等信息計算得出待測樣中目標(biāo)抗原的濃度。
3.分類：
根據(jù)免疫識別和信號輸出方式的不同，ELISA可以分為雙抗體夾心法、直接免疫競爭法和非直接免疫競爭法等等。其中雙抗體夾心法在應(yīng)用上最常見。
雙抗體夾心法類型分為直接夾心和間接夾心。檢測抗體是酶標(biāo)抗體，則可稱為直接夾心ELISA；檢測抗體不帶有標(biāo)記，則還需要使用酶標(biāo)二抗與檢測抗體結(jié)合，這種稱為間接夾心ELISA。
直接夾心又分為雙抗體夾心和雙抗原夾心。夾心ELISA實驗需要用到配對抗體（捕獲抗體和檢測抗體），
3.1、原理：
將捕獲抗體結(jié)合到ELISA板上，通過捕獲抗體固定抗原，隨后通過直接或間接ELISA的方式進(jìn)行檢測。在夾心ELISA實驗中，最重要的是對配對抗體進(jìn)行驗證，確保配對抗體能同時與抗原結(jié)合，以確保實驗的順利進(jìn)行。
3.2、特點：
常用于抗原測定，適用于測定二價或二價以上的大分子抗原，不適用于測定半抗原及小分子單價抗原。優(yōu)點：高靈敏、高專一性，抗原無須事先純化。缺點：抗原一定得擁有兩個以上的抗體結(jié)合部位。
3.3：雙抗體夾心法步驟：
①：抗體包被 在96孔板上包被抗體。由于酶標(biāo)板是由聚苯乙烯制成，其含有的苯環(huán)與抗體的氨基酸殘基具有類似π-π堆積作用的引力，結(jié)合靜電和疏水作用，可以將抗體吸附于其表面。然后，將未吸附的抗體用緩沖液清洗后，加入含有明膠或牛血清蛋白（Bovine Serum Albumin, BSA）的封閉液以封閉酶標(biāo)板上未結(jié)合抗體的部分。加入封閉液的目的，是防止其他蛋白因靜電或疏水作用吸附在96孔板上，造成假陽性信號，干擾后續(xù)實驗的進(jìn)行。
②：免疫識別 在96孔板上包被抗體后，加入待測樣，并在37°C環(huán)境下孵育一段時間，通常是1-2小時。此時酶標(biāo)板上的抗體與待測抗原進(jìn)行特異性識別結(jié)合。此處抗體的質(zhì)量是關(guān)鍵，好的抗體既能特異性高效地結(jié)合抗原又不受待測樣中其他生物大分子、蛋白質(zhì)和無機(jī)鹽等成分的影響。
③：洗板 將未結(jié)合的抗原洗掉，加入該抗原所對應(yīng)的識別抗體并在37°C下繼續(xù)培養(yǎng)1-2小時，接著將未連接上抗原的抗體洗掉。
④：酶標(biāo)信號輸出 加入帶有辣根過氧化酶（Horseradish Peroxidase, HRP）標(biāo)記的酶標(biāo)二抗，用于和標(biāo)準(zhǔn)抗體結(jié)合。在培養(yǎng)30分鐘后洗掉未連接的二抗，并加入顯色劑顯色。根據(jù)顯色的結(jié)果判斷抗原的濃度。一般認(rèn)為，抗原濃度與顯色后的發(fā)光強(qiáng)度呈正相關(guān)。
免疫競爭法：
以抗原競爭抗體為例，在上述免疫夾心法操作步驟的第二步加入待測抗原后，立刻加入酶標(biāo)抗原，使之與待測抗原競爭識別酶標(biāo)板上的抗體。當(dāng)待測抗原濃度越高，能夠連上酶標(biāo)板上抗體的酶標(biāo)抗體就越少，輸出的信號就越少。這樣待測樣濃度與酶顯色信號就呈逆相關(guān)。
1.原理：
免疫分析是一種利用特定抗體與抗原或半抗原發(fā)生的高選擇性高特異性識別和結(jié)合原理，對待測抗體或者抗原進(jìn)行分析測定的方法，酶聯(lián)免疫吸附分析（下稱ELISA）是免疫分析的一種，分三個部分組成：免疫識別，信號輸出和數(shù)據(jù)處理。
2.步驟：
免疫識別是在聚苯乙烯制成的96孔板上包被抗體，而后利用抗體識別待測的抗原（通常是疾病的蛋白質(zhì)生物標(biāo)記物，病毒，細(xì)菌等等，從復(fù)雜待測液中將抗原吸附到96孔板表面。接著用帶有辣根過氧化酶（Horseradish Peroxidase, HRP）、熒光或放射性標(biāo)記的抗體通過直接或者間接的方式輸出識別信號。最后利用信號強(qiáng)度，標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度梯度等信息計算得出待測樣中目標(biāo)抗原的濃度。
3.分類：
根據(jù)免疫識別和信號輸出方式的不同，ELISA可以分為雙抗體夾心法、直接免疫競爭法和非直接免疫競爭法等等。其中雙抗體夾心法在應(yīng)用上最常見。
雙抗體夾心法類型分為直接夾心和間接夾心。檢測抗體是酶標(biāo)抗體，則可稱為直接夾心ELISA；檢測抗體不帶有標(biāo)記，則還需要使用酶標(biāo)二抗與檢測抗體結(jié)合，這種稱為間接夾心ELISA。
直接夾心又分為雙抗體夾心和雙抗原夾心。夾心ELISA實驗需要用到配對抗體（捕獲抗體和檢測抗體），
3.1、原理：
將捕獲抗體結(jié)合到ELISA板上，通過捕獲抗體固定抗原，隨后通過直接或間接ELISA的方式進(jìn)行檢測。在夾心ELISA實驗中，最重要的是對配對抗體進(jìn)行驗證，確保配對抗體能同時與抗原結(jié)合，以確保實驗的順利進(jìn)行。
3.2、特點：
常用于抗原測定，適用于測定二價或二價以上的大分子抗原，不適用于測定半抗原及小分子單價抗原。優(yōu)點：高靈敏、高專一性，抗原無須事先純化。缺點：抗原一定得擁有兩個以上的抗體結(jié)合部位。
3.3：雙抗體夾心法步驟：
①：抗體包被 在96孔板上包被抗體。由于酶標(biāo)板是由聚苯乙烯制成，其含有的苯環(huán)與抗體的氨基酸殘基具有類似π-π堆積作用的引力，結(jié)合靜電和疏水作用，可以將抗體吸附于其表面。然后，將未吸附的抗體用緩沖液清洗后，加入含有明膠或牛血清蛋白（Bovine Serum Albumin, BSA）的封閉液以封閉酶標(biāo)板上未結(jié)合抗體的部分。加入封閉液的目的，是防止其他蛋白因靜電或疏水作用吸附在96孔板上，造成假陽性信號，干擾后續(xù)實驗的進(jìn)行。
②：免疫識別 在96孔板上包被抗體后，加入待測樣，并在37°C環(huán)境下孵育一段時間，通常是1-2小時。此時酶標(biāo)板上的抗體與待測抗原進(jìn)行特異性識別結(jié)合。此處抗體的質(zhì)量是關(guān)鍵，好的抗體既能特異性高效地結(jié)合抗原又不受待測樣中其他生物大分子、蛋白質(zhì)和無機(jī)鹽等成分的影響。
③：洗板 將未結(jié)合的抗原洗掉，加入該抗原所對應(yīng)的識別抗體并在37°C下繼續(xù)培養(yǎng)1-2小時，接著將未連接上抗原的抗體洗掉。
④：酶標(biāo)信號輸出 加入帶有辣根過氧化酶（Horseradish Peroxidase, HRP）標(biāo)記的酶標(biāo)二抗，用于和標(biāo)準(zhǔn)抗體結(jié)合。在培養(yǎng)30分鐘后洗掉未連接的二抗，并加入顯色劑顯色。根據(jù)顯色的結(jié)果判斷抗原的濃度。一般認(rèn)為，抗原濃度與顯色后的發(fā)光強(qiáng)度呈正相關(guān)。
免疫競爭法：
以抗原競爭抗體為例，在上述免疫夾心法操作步驟的第二步加入待測抗原后，立刻加入酶標(biāo)抗原，使之與待測抗原競爭識別酶標(biāo)板上的抗體。當(dāng)待測抗原濃度越高，能夠連上酶標(biāo)板上抗體的酶標(biāo)抗體就越少，輸出的信號就越少。這樣待測樣濃度與酶顯色信號就呈逆相關(guān)。
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