蛋白定量測定是實驗生物學中一種常用的技術，用于測量樣品中蛋白質(zhì)的濃度或總量。這種測定對于生物化學、分子生物學、醫(yī)學研究等領域非常重要。

圖1. 定量蛋白組分析

一、蛋白定量的基本流程包括：

 

樣品制備：細胞提取物、組織樣品、血清、血漿、尿液或其他包含蛋白質(zhì)的生物樣品。確保樣品是干凈的，沒有雜質(zhì)。
選擇測定方法：選擇適合你的實驗需求的蛋白定量方法。
制備標準曲線：制備一系列已知濃度的標準樣品，需要標準曲線來測定蛋白質(zhì)濃度。
測定樣品：將樣品與測定方法中的試劑混合，按照方法要求的步驟進行反應。根據(jù)反應產(chǎn)物的顏色、吸光度或其他特性，使用分光光度計或其他相關儀器測量并記錄結果。
計算蛋白質(zhì)濃度：根據(jù)標準曲線或測定方法的公式，計算出樣品中的蛋白質(zhì)濃度。

二、蛋白定量的常見方法包括：

1、Bradford 蛋白質(zhì)測定法：

 

原理：這種方法基于柯馬斯亮藍G-250染料與蛋白質(zhì)結合時所發(fā)生的顏色變化。
優(yōu)點：操作簡單，靈敏度較高。
缺點：受到洗滌劑和其他化學物質(zhì)的干擾。

2、Lowry 法：

 

原理：基于銅離子在堿性條件下與蛋白質(zhì)中的多肽鍵結合，并進一步與Folin-Ciocalteu試劑反應產(chǎn)生顏色變化。
優(yōu)點：適用于較低濃度的蛋白質(zhì)。
缺點：步驟比Bradford法更復雜，且易受其他物質(zhì)的干擾。

3、BCA法（雙縮脲酸法）：

 

原理：與Lowry 法類似，但使用BCA試劑，對銅離子和蛋白質(zhì)反應更為敏感。
優(yōu)點：適用于微量蛋白質(zhì)的測定，穩(wěn)定性好。
缺點：需要較長的孵育時間。

4、紫外吸收光譜法：

 

原理：蛋白質(zhì)中的色氨酸和酪氨酸在紫外光下有特定的吸收峰。
優(yōu)點：快速且不需要添加任何試劑。
缺點：對其他物質(zhì)的吸收干擾敏感，需要較純凈的樣品。

5、基于質(zhì)譜技術的蛋白定量

 

1）無標記定量

 

原理：不使用化學標簽，直接通過分析肽段離子的強度或計數(shù)來定量蛋白質(zhì)。
優(yōu)點：操作簡化，適用于廣泛的樣品類型，無需額外的化學修飾。
缺點：對樣品制備和質(zhì)譜操作的質(zhì)量要求高，數(shù)據(jù)處理和解釋較為復雜。

2）iTRAQ/TMT

 

原理：使用特殊的化學標簽對樣品中的蛋白質(zhì)進行標記。在質(zhì)譜中，標記產(chǎn)生特定的裂解離子，用于定量分析。
優(yōu)點：可以同時分析多個樣本，提高了實驗的吞吐量。
缺點：高成本，數(shù)據(jù)處理復雜，對實驗設計和執(zhí)行有較高要求。

3）同位素編碼親和標記（ICAT）

 

原理：使用含有不同同位素的化學標簽對蛋白質(zhì)或肽段進行標記，然后利用質(zhì)譜分析比較不同樣本中蛋白質(zhì)的相對豐度。
優(yōu)點：提供了準確的蛋白質(zhì)相對量比較，可用于復雜樣品。
缺點：成本較高，操作復雜，可能無法檢測未標記的蛋白質(zhì)。

4）SWATH-MS

 

原理：基于數(shù)據(jù)獨立采集，通過系統(tǒng)地掃描所有預定質(zhì)量窗口來收集質(zhì)譜數(shù)據(jù)。
優(yōu)點：提供高通量、高重復性的定量信息，適合復雜樣品分析。
缺點：需要高級的數(shù)據(jù)處理技術，對儀器性能要求高。

5）多重反應監(jiān)測（MRM）

 

原理：選擇特定的前體離子和產(chǎn)物離子對，用于定量特定肽段或蛋白質(zhì)。
優(yōu)點：高度特異性，靈敏度高，適合低豐度目標蛋白的定量。
缺點：每次只能定量有限數(shù)量的目標蛋白，需要事先知道目標蛋白的信息。