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過氧化PRDX3作為鐵死亡標(biāo)志物的鑒定與其應(yīng)用

瀏覽次數(shù)：503　發(fā)布日期：2024-1-15　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

鐵死亡大家并不陌生，但由于缺乏特定的標(biāo)記物，在生理?xiàng)l件下識別鐵死亡一直具有挑戰(zhàn)性。近期，Mol Cell 報(bào)道了首個(gè)鐵死亡的標(biāo)志物 Hyperoxidized PRDX3 的發(fā)現(xiàn)！快隨小 M 一起看看吧~

近期，Jin Ye 團(tuán)隊(duì)發(fā)表的文章 “Identification of hyperoxidized PRDX3 as a ferroptosis marker reveals ferroptotic damage in chronic liver diseases”[1]，鑒定出首個(gè)鐵死亡特異性標(biāo)記物--Hyperoxidized PRDX3 (過氧化PRDX3)。該研究結(jié)果為鐵死亡領(lǐng)域提供了一個(gè)期待已久的鐵死亡標(biāo)記物，從而能夠更精確地檢測這種獨(dú)特的細(xì)胞死亡形式。

縮略詞

GPX4 : Glutathione peroxidase 4, 谷胱甘肽過氧化物酶 4

SLC7A11: Solute carrier family 7 member 11 , 溶質(zhì)載體家族 7 成員 11

GSH: Cyst(e)ine-glutathione, 半胱氨酸-谷胱甘肽

GPX4: Glutathione peroxidase 4, 谷胱甘肽過氧化物酶 4

PRDX3: Peroxiredoxin 3, 過氧化過氧化還原蛋白 3

PRDXs: Peroxiredoxins, 過氧化還原蛋白

AFLD: Alcoholic fatty liver diseases, 酒精性脂肪肝

NAFLD: Nonalcoholic fatty liver diseases, 非酒精性脂肪肝

HFD: High fat diet, 高脂飲食

鐵死亡是一種由脂質(zhì)過氧化引起的調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡形式[2]。其主要防御機(jī)制是 SLC7A11-GSH-GPX4 軸[3]。在正常情況下 (圖 1A)，SLC7A11 介導(dǎo)胱氨酸攝取，并產(chǎn)生半胱氨酸 (Cys, Cysteine)，促進(jìn)了 GSH 的生物合成。GSH 是 GPX4 的輔助因子，可有效解毒脂質(zhì)過氧化，抑制氧化應(yīng)激損傷。

圖 1. 過度氧化的 PRDX3 參與鐵死亡^[1]。

而在鐵死亡脅迫期間（圖 1B），PRDX3 由于暴露于線粒體脂質(zhì)過氧化物而發(fā)生過度氧化。隨后，過度氧化的 PRDX3 (SO_2/3-PRDX3) 從線粒體易位到質(zhì)膜上 (也可能是線粒體 PRDX3 先重新定位到質(zhì)膜上，然后在質(zhì)膜上發(fā)生過度氧化)，質(zhì)膜上 SO_2/3-PRDX3 的存在抑制了胱氨酸的攝取，從而促進(jìn)了鐵死亡[1][2]。

PRDX3 是一種線粒體特異性過氧化物酶，是抗氧化酶家族 PRDXs 的成員之一。PRDXs 代表分布在各種細(xì)胞器中的多種酶抗氧化系統(tǒng)之一，并且根據(jù) Cys 殘基的數(shù)量和位置對 PRDXs 的不同亞型進(jìn)行劃分。哺乳動物 PRDXs (PRDX 1-6) 的六種亞型具有一或兩個(gè)保守的 Cys 殘基 (Peroxidatic Cys; CP; Resolving Cys; CR)。PRDXs 亞型根據(jù)保守的 Cys 殘基的數(shù)量和位置以及催化循環(huán)過程中產(chǎn)生的二硫鍵的類型分為三種不同的形式。其中最為典型的是 2-Cys PRDX。

在正常情況下，典型的 2-Cys PRDXs，包括 PRDX1-4，可通過催化性 Cys 來還原過氧化物。反應(yīng)產(chǎn)生的半胱磺酸 (Cys-SOH) 充當(dāng)連接劑，利用二硫鍵連接過氧化 PRDXs 產(chǎn)生同二聚體。Cys-SOH 再被還原為 Cys，又可以重新參與到 PRDXs 的催化循環(huán)中 (反應(yīng) 1-3)。

圖 2. PRDXs 的過氧化催化循環(huán)^[1]。

當(dāng)過量的過氧化物積累時(shí)，二硫鍵形成的速率不夠快，會導(dǎo)致 PRDXs 中的 Cys-SOH 被過氧化物進(jìn)一步氧化，生成半胱亞磺酸 (Cys-SO₂H)、磺酸 (Cys-SO₃H)，這是 PRDXs 的過氧化物 (反應(yīng) 4-5)。因此，脂質(zhì)過氧化物在鐵細(xì)胞中的積累可能被 PRDXs 感知，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的過度氧化。

▐ PRDX3 在鐵死亡細(xì)胞中被特異性過度氧化

作者使用可識別包含 PRDX1-4 的 Cys-SO_2/3 H 的肽的抗體進(jìn)行了免疫印跡分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1) 在未經(jīng)處理的 SV589 細(xì)胞中幾乎檢測不到任何信號; (2) 添加鐵死亡誘導(dǎo)劑如 erastin、RSL3 或 FIN56 (圖中僅顯示 erastin) 處理的細(xì)胞中觀察到~23 kDa 的單條帶 (圖 3B)。此外，該條帶的檢測可被抗體與過氧化抗原 (SO₃-PRDX1-4 Peptide) 共孵育所阻斷，但未被未修飾的對照肽阻斷 (圖 3B)，表明該抗體特異性靶向過氧化 PRDX1-4。

圖 3. PRDX3 在鐵死亡過程中被過度氧化^[1]。

(A) 通過免疫印跡分析測定用指定濃度的 erastin、RSL3 或 FIN56 (此處未顯示) 處理12 小時(shí)的 SV589 細(xì)胞中的過氧化量和總 PRDX1–4 量。(B) 加或不加 2µM erastin 處理 12 小時(shí)的細(xì)胞，在不存在 2 µg/mL 阻斷性高氧化抗原肽或未修飾的對照肽的情況下進(jìn)行免疫印跡分析。(C) 加或不加 200 nM erastin2 處理 12 小時(shí)的細(xì)胞裂解物在同一印跡中通過抗 PRDX3 和抗 SO_2/3-PRDX1–4 進(jìn)行免疫印跡，然后用分別紅色和綠色熒光標(biāo)記的二抗進(jìn)行檢測。

由于 PRDX1-4 之間的分子量不同，且僅在鐵死亡細(xì)胞中檢測到 ∼23 kDa 的單個(gè)條帶，表明在這種條件下只有一個(gè) PRDX 被過度氧化。在同一印跡中通過抗 PRDX3 和抗 SO_2/3 -PRDX1–4 進(jìn)行免疫印跡，由 erastin 衍生物 erastin 2 誘導(dǎo)的過氧化 PRDX 與 PRDX3 一起遷移 (圖 3C)，證明了 PRDX3 在鐵死亡過程中被特異性過度氧化。

▐ 過氧化 PRDX3 通過抑制胱氨酸攝取誘導(dǎo)鐵死亡

作者評估了過度氧化的 PRDX3 對其他化合物誘導(dǎo)的鐵死亡的影響，結(jié)果表明，PRDX3-/- 能夠更敏感地抑制直接作用于胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的鐵死亡誘導(dǎo)劑（例如 erastin 和 SAS），而對作用于下游 GPX4 水平的誘導(dǎo)劑（例如 RSL3 和 FIN56）敏感度降低。也就是說，過度氧化的 PRDX3 很有可能與 erastin 和 SAS 一樣，通過抑制胱氨酸攝取來誘導(dǎo)鐵死亡 (圖 4A)。同時(shí)，利用熒光染色定位，研究人員發(fā)現(xiàn)本來存在于線粒體的 PRDX3 在過氧化修飾后轉(zhuǎn)移到了細(xì)胞膜上(圖 4C)。

圖 4. 過氧化 PRDX3 可抑制胱氨酸攝取誘導(dǎo)鐵死亡^[1]。

(A) erastin 處理細(xì)胞 24 小時(shí)后的活力測定；(B) 加或不加Deferoxamine (DFO, 50 μM) 或 Ferrostatin-1 (Fer, 1 μM) 的情況下，在指定時(shí)間內(nèi)缺乏胱氨酸的指定細(xì)胞的活力測定。(C) 加或不加 200 nM erastin2 處理 12 小時(shí)細(xì)胞，使用指定抗體和 MitoTracker 進(jìn)行免疫熒光顯微鏡檢查。

隨后，將細(xì)胞與 erastin 預(yù)孵育 9 小時(shí) (9 h 后 WT 細(xì)胞中產(chǎn)生過氧化 PRDX3)，檢查過氧化的 PRDX3 對胱氨酸攝取的影響。結(jié)果表明，WT 細(xì)胞中的胱氨酸攝取受到抑制，但 PRDX3-/- 細(xì)胞中則不受抑制 (圖中未顯示)，也就是說，過氧化的 PRDX3 可抑制胱氨酸攝取。

那么，過氧化的 PRDX3 是否通過抑制胱氨酸攝取來促進(jìn)鐵死亡呢？作者比較了 PRDX3-/- 和 WT 細(xì)胞在胱氨酸耗盡培養(yǎng)基中的活力 (該培養(yǎng)基不提供胱氨酸攝取的細(xì)胞外來源)。結(jié)果表明，WT 細(xì)胞中產(chǎn)生了過度氧化的 PRDX3，且可以通過鐵死亡抑制劑 Deferoxamine 或 Ferrostatin-1 來挽救 (圖 4B)。這些結(jié)果表明，過氧化的 PRDX3 通過抑制胱氨酸輸入促進(jìn)鐵死亡。

▐ 過氧化的 PRDX3 特異存在于鐵死亡細(xì)胞中

為進(jìn)一步評估過度氧化的 PRDX3 是否可以作為鐵死亡的標(biāo)志物。作者發(fā)現(xiàn)，在 SV589 細(xì)胞中，PRDXs 的過度氧化不因?yàn)榘l(fā)生細(xì)胞凋亡或者壞死性凋亡而產(chǎn)生 (圖 5A, C)，也不因?yàn)殂~死亡誘導(dǎo)劑 Elesclomol 或 CCCP 的處理而產(chǎn)生，PRDX3 只在鐵死亡中積累，具有特異性(圖 5B,D)。

圖 5. 不同細(xì)胞死亡類型中，只有鐵死亡細(xì)胞中存在過氧化 PRDX3^[1]。

(A) 通過免疫印跡分析測定用指定濃度的 erastin 或camptothecin 處理 12 小時(shí)的 SV589 細(xì)胞中過氧化的 PRDX3 和裂解的 C-caspase3 的量; (B) 通過免疫印跡分析測定用 2 μM erastin 或 4 μM CCCP 處理 12 小時(shí)的 SV589 細(xì)胞中過氧化 PRDX3 的量; (C) 用 20 ng/mL TNF-α、100 nM SM164 和 20 μM z-VAD (T/S/Z) 或 2 μM erastin 處理指定時(shí)間的 HT29 細(xì)胞中過氧化 PRDX3 和 p-MLKL 的量，通過免疫印跡分析確定; (D) 通過免疫印跡分析測定用 2 μM erastin 或指定濃度的 elesclomol 加2 μM CUCL₂ 處理 12 小時(shí)的 SV589 細(xì)胞中過氧化 PRDX3 的量。

作者應(yīng)用過氧化的 PRDX3 作為標(biāo)記物，確定了鐵死亡是導(dǎo)致 AFLD 和 NAFLD 小鼠模型中肝細(xì)胞死亡的原因。過度氧化的 PRDX3 揭示了 AFLD 和 NAFLD 中的鐵死亡損傷。在用對照飲食喂養(yǎng)的小鼠中看不到過度氧化的 PRDX3，但在 > 70% 的用乙醇喂養(yǎng)的小鼠（長期和暴飲暴食乙醇形成的 AFLD 小鼠模型）和在約 70% 的飼喂 HFD 的小鼠（長期高脂飲食 (HFD) 喂養(yǎng)的 NAFLD 小鼠模型）的肝臟中檢測到鐵死亡標(biāo)記物。此外，在 AFLD 和 NAFLD 小鼠模型中，肝臟中過度氧化 PRDX3 的水平與肝損傷的標(biāo)志物 AST 和 ALT 水平 (肝損傷標(biāo)志物) 呈正相關(guān)。

小 M 還為大家整理了相關(guān)細(xì)胞死亡標(biāo)志物匯總，有需求的小伙伴可以收藏備用喔~

表 1. 鐵死亡與其他細(xì)胞死亡的生物標(biāo)志物匯總^[4]^[5]^[6]^[7]。

本文小 M 帶大家一起認(rèn)識了高分文獻(xiàn)中驗(yàn)證 PRDX3 是鐵死亡特異性標(biāo)志物的思路和方法。過度氧化的 PRDX3 通過抑制胱氨酸輸入促進(jìn)鐵死亡，決定了它獨(dú)一無二的身份，為鐵死亡研究領(lǐng)域填補(bǔ)了空白的一環(huán)。

Erastin

鐵死亡誘導(dǎo)劑，結(jié)合且抑制電壓依賴性陰離子通道 (VDAC2/VDAC3)。

RSL3

鐵死亡誘導(dǎo)劑，可直接降低 GPX4 的表達(dá)。

FIN56

鐵死亡誘導(dǎo)劑，可導(dǎo)致 GPX4 降解來誘導(dǎo)鐵死亡。

Sorafenib

鐵死亡誘導(dǎo)劑，還誘導(dǎo)細(xì)胞自噬和凋亡。

Deferoxamine

鐵螯合劑，可結(jié)合 Fe(III) 和許多其他金屬陽離子。

抗氧化劑和鐵死亡抑制劑。

胱氨酸耗竭會誘導(dǎo)鐵死亡。

用于測量線粒體膜電位的熒光探針試劑盒。

親脂性紅色熒光染料，可用于線粒體膜電位檢測。

鐵死亡化合物庫

收集了 500+ 種文獻(xiàn)報(bào)道的具有誘導(dǎo)或抑制鐵死亡相關(guān)的化合物及與鐵死亡密切相關(guān)的靶點(diǎn)對應(yīng)的化合物，可以用于鐵死亡機(jī)制及相關(guān)疾病的研究。

MCE的所有產(chǎn)品僅用作科學(xué)研究或藥證申報(bào)，我們不為任何個(gè)人用途提供產(chǎn)品和服務(wù)。

參考文獻(xiàn)：
[1] Cui S, et al. Identification of hyperoxidized PRDX3 as a ferroptosis marker reveals ferroptotic damage in chronic liver diseases. Mol Cell. 2023 Nov 2;83(21):3931-3939.e5.

[2] Yan Y, Gan B. Hyperoxidized PRDX3 as a specific ferroptosis marker[J]. Life Metabolism, 2023: load042.

[3] Li J, et al. Ferroptosis: past, present and future. Cell Death Dis. 2020 Feb 3;11(2):88.

[4] Loveless R, Bloomquist R, Teng Y. Pyroptosis at the forefront of anticancer immunity. J Exp Clin Cancer Res. 2021 Aug 24;40(1):264.

[5] Frank D, et al. Pyroptosis versus necroptosis: similarities, differences, and crosstalk. Cell Death Differ. 2019 Jan;26(1):99-114.

[6] Zhao G, et al. Copper induce zebrafish retinal developmental defects via triggering stresses and apoptosis. Cell Commun Signal. 2020 Mar 14;18(1):45.

[7] Wang L, et al. The emerging mechanisms and functions of microautophagy. Nat Rev Mol Cell Biol. 2023 Mar;24(3):186-203.

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