由于細(xì)胞支原體污染的隱蔽性及對(duì)細(xì)胞的嚴(yán)重影響，細(xì)胞的支原體污染已經(jīng)成為了一個(gè)比較棘手的世界性難題。實(shí)驗(yàn)室新引進(jìn)的細(xì)胞，應(yīng)該比較采取一定的方法檢測(cè)確定沒有支原體污染才能使用。

1、培養(yǎng)法

培養(yǎng)法是最傳統(tǒng)的支原體污染檢測(cè)方法，也是最早的檢測(cè)方法，基本實(shí)驗(yàn)步驟首先是將細(xì)胞培養(yǎng)物置于支原體肉湯液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)3天后離心，將沉淀物轉(zhuǎn)移至支原體固體瓊脂培養(yǎng)基中，相同條件下培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)基中若有類似煎雞蛋樣菌落出現(xiàn)，則細(xì)胞被支原體污染了。培養(yǎng)法簡(jiǎn)單直觀，大多數(shù)支原體可出現(xiàn)特有的典型菌落，但是支原體生長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)一代大3-4小時(shí)，一般需要培養(yǎng)28天才能判斷是否有支原體的污染，工作量大，而且有進(jìn)一步擴(kuò)大支原體傳播的風(fēng)險(xiǎn)。支原體對(duì)培養(yǎng)條件比較苛刻，培養(yǎng)基成分質(zhì)量或批次的不同都會(huì)對(duì)支原體的正常生長(zhǎng)產(chǎn)生影響，而且有一些支原體無法通過培養(yǎng)法生長(zhǎng)，因此使用培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果并不準(zhǔn)確容易產(chǎn)生假陰性。為了減輕支原體培養(yǎng)法的工作量，縮短檢測(cè)時(shí)間，需要一種快速簡(jiǎn)單的檢測(cè)方法阻止支原體污染的擴(kuò)散，出現(xiàn)了使用DNA熒光染色法檢測(cè)支原體的方法。

2、DNA熒光染色法

DNA熒光染色法是利用熒光試劑Hoechst 33258等標(biāo)記細(xì)胞和支原體DNA，熒光染料會(huì)結(jié)合到DNA的A-T富集區(qū)域，因?yàn)橹г�體DNA中A-T含量占多數(shù)，所以可將其染色，染料在紫外光激發(fā)下產(chǎn)生黃綠色熒光，利用熒光顯微鏡觀察支原體是否存在。正常細(xì)胞核區(qū)見邊緣整齊清晰的熒光，胞質(zhì)區(qū)無熒光。被支原體污染的細(xì)胞不僅在細(xì)胞核而且在細(xì)胞核外及細(xì)胞膜上均可見許多大小均一之熒光小點(diǎn)，即為支原體DNA，證明細(xì)胞被支原體污染了。由于該方法不需要培養(yǎng)支原體，只需要用熒光顯微鏡觀察，操作較為簡(jiǎn)便，檢測(cè)快速。但是該方法靈敏度比較低，因背景熒光的存在，細(xì)胞輕度支原體污染不易檢出。細(xì)胞裂解死亡產(chǎn)生碎片也會(huì)被熒光染料染色被誤認(rèn)為是支原體染色所致造成假陽性。DNA熒光染色法比細(xì)胞培養(yǎng)法檢測(cè)縮短了檢測(cè)時(shí)間但靈敏度和準(zhǔn)確性不高且檢測(cè)時(shí)需要熒光顯微鏡。熒光染色法不能確定具體是哪種支原體導(dǎo)致的細(xì)胞污染。熒光染色法一般要求培養(yǎng)無污染的指示細(xì)胞作為對(duì)照，增加了檢測(cè)的工作量。

鑒于DNA熒光染色法的不足之處，出現(xiàn)了靈敏度和準(zhǔn)確性更高的PCR（Polymerase Chain Reaction）檢測(cè)支原體方法，Remy Teyssoud等以支原體的16SrRNA核酸序列中高度保守序列設(shè)計(jì)引物，采用PCR的方法檢測(cè)細(xì)胞中的支原體污染。支原體作為一種原核生物，其rRNA基因是由保守和多變序列間隔排列而成，能夠作為生物分類的指標(biāo)。PCR以4種dNTP為底物，在引物存在的情況下，在DNA模板的3’末端進(jìn)行互補(bǔ)鏈的延伸，多次反復(fù)的循環(huán)能使微量的模板核酸得到指數(shù)級(jí)的擴(kuò)增。PCR檢測(cè)方法尤其適用于培養(yǎng)困難而且耗時(shí)的支原體的檢測(cè)鑒定。

3、PCR法：

PCR法檢測(cè)支原體基本步驟包括提取待測(cè)細(xì)胞上清，在PCR總反應(yīng)體系中加入PCR緩沖液、氯化鎂、Taq酶、dNTP、模板和引物，設(shè)置擴(kuò)增條件擴(kuò)增反應(yīng)。取微量擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，用紫外檢測(cè)儀觀察并用凝膠成像系統(tǒng)照相，觀察是否有目的片段出現(xiàn)。PCR方法由于引物設(shè)計(jì)特異性較強(qiáng)，可以進(jìn)行種屬的鑒別。比常規(guī)培養(yǎng)法檢測(cè)時(shí)間大大縮短，比DNA熒光染色法具有較高的特異性，能夠鑒別支原體的不同種。PCR產(chǎn)物的分析一般采用瓊脂糖凝膠電泳分析，初步判斷PCR產(chǎn)物片段的大小與預(yù)計(jì)是否一致。但最令人頭痛的問題是PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物污染，因?yàn)镻CR 產(chǎn)物拷貝量大，極其微量的污染即可造成假陽性的產(chǎn)生。最可能造成PCR 產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染，在操作時(shí)比較劇烈地?fù)u動(dòng)反應(yīng)管，尤其是打開反應(yīng)管的蓋進(jìn)行電泳點(diǎn)樣操作時(shí)都可形成氣溶膠而污染。一個(gè)氣溶膠顆粒包含大量拷貝，因而由氣溶膠造成的污染產(chǎn)生的假陽性是一個(gè)值得特別重視 的問題，而且PCR一次只能檢測(cè)一個(gè)指標(biāo)。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，逐漸發(fā)展了利用熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行支原體檢測(cè)手段，如Melanie Stormer等利用熒光定量PCR方法快速檢測(cè)細(xì)胞中的支原體污染。

4、熒光定量PCR法：

熒光定量PCR法( realtime fluorescence quantitative PCR)是1996年由美國(guó)Applied Biosystems 公司推出的一種核酸新定量試驗(yàn)技術(shù)，熒光定量PCR是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光探針或相應(yīng)的熒光染料來實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)定量的。隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一次熒光信號(hào)，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)中Ct值是指每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代表Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)支原體主要的步驟包括支原體特異引物和探針的設(shè)計(jì)，陽性標(biāo)準(zhǔn)品的制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，熒光定量PCR特異性實(shí)驗(yàn)，敏感性實(shí)驗(yàn)和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，最后是用待測(cè)細(xì)胞上清液上機(jī)檢測(cè)，通過Ct值及擴(kuò)增曲線判斷。隨著實(shí)時(shí)熒光定量PCR的使用，出現(xiàn)了很多利用此技術(shù)檢測(cè)支原體的研究，Lorenzon S等利用熒光定量PCR方法檢測(cè)肺炎支原體capripneumoniae等，2017年Gerlier等發(fā)明了利用熒光定量PCR檢測(cè)支原體的專利。實(shí)時(shí)熒光定量PCR簡(jiǎn)化了操作步驟，采用閉管檢測(cè)可避免PCR跑膠導(dǎo)致的氣溶膠假陽性的出現(xiàn)，敏感性高，可以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)控，還可以實(shí)現(xiàn)定量判斷。實(shí)時(shí)熒光定量PCR具有比PCR檢測(cè)快，靈敏度高的優(yōu)勢(shì)，尤其適合樣品模板含量較低時(shí)使用，實(shí)時(shí)熒光定量PCR能通過溶解曲線能夠判斷特異性擴(kuò)增。實(shí)時(shí)熒光定量PCR需要配套價(jià)格高昂的熒光定量PCR儀器，而且設(shè)備維護(hù)費(fèi)用高，機(jī)器設(shè)置操作復(fù)雜，需專業(yè)人員，難以得到全面推廣。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification method,LAMP)是一種新興的基因擴(kuò)增技術(shù)，由日本學(xué)者Notomi 2000年在Nucleic AcidsRes雜志上公開發(fā)表，作為一種分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，現(xiàn)先已廣泛應(yīng)用于分子檢測(cè)領(lǐng)域，2005年Saito R等人發(fā)表了LAMP法快速檢測(cè)肺炎支原體的文章。2014年HEYing等用LAMP方法快速檢測(cè)capripneumoniae支原體，2016年美國(guó)Jonas M等發(fā)明了利用LAMP方法檢測(cè)肺炎支原體的專利。 2016年曹振發(fā)明了一種檢測(cè)廣譜支原體的LAMP方法的專利。2017年Matsuzaki I等使用LAMP用于基因轉(zhuǎn)移的快速檢測(cè)。LAMP原理是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異引物，在鏈置換DNA聚合酶(如Bst 酶)的作用下，水浴鍋中63℃左右，60分鐘即可實(shí)現(xiàn)109～1010倍的核酸擴(kuò)增，具有很高的擴(kuò)增效率，操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)不需要使用特殊的儀器。LAMP雖然增加了擴(kuò)增效率，但引物間的非特異性配對(duì)容易導(dǎo)致假陽性結(jié)果，限制了LAMP方法的使用。

由于實(shí)時(shí)熒光定量PCR需要配套的儀器，且操作復(fù)雜，需要有經(jīng)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)人員對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，而LAMP法會(huì)出現(xiàn)假陽性問題，使實(shí)時(shí)熒光定量PCR和LAMP法在檢測(cè)支原體污染上都存在一定的弊端，為了尋求一種使用簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確支原體檢測(cè)方法，出現(xiàn)了利用支原體酶這一特定活性檢測(cè)支原體的ATP酶法，如Lonza公司推出的商品化的Mycoalert支原體檢測(cè)試劑盒，ATP酶法是采用生物發(fā)光的原理，檢測(cè)支原體酶活性，其檢測(cè)的支原體酶廣泛存在于180多種支原體中，而這種酶不存在于真核細(xì)胞中。當(dāng)支原體被裂解后，釋放的酶與反應(yīng)底物發(fā)生催化反應(yīng)，將ADP轉(zhuǎn)化成ATP，通過熒光分光光度計(jì)測(cè)量樣品中添加底物前后ATP的含量，可以得到一個(gè)比率，該比率指示支原體是否存在。如果這些酶不存在，第二次讀數(shù)相對(duì)于第一次讀數(shù)就沒有增加，如果酶與底物進(jìn)行特異性反應(yīng)，就會(huì)導(dǎo)致ATP含量上升。ATP含量的上升通過生物發(fā)光化學(xué)反應(yīng)可以檢測(cè)到，讀數(shù)上升表明存在支原體污染。

5、ATP酶法

ATP酶法能夠檢測(cè)的支原體種類比較全，檢測(cè)結(jié)果能夠量化，容易判斷，耗時(shí)短，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程需要20分鐘左右。由于ATP酶法主要依賴支原體酶活性的發(fā)揮，任何影響酶活性的發(fā)揮都有可能影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，2015年Vahid Molla Kazemiha等研究發(fā)現(xiàn)ATP酶法的靈敏度和準(zhǔn)確性要低于實(shí)時(shí)熒光定量PCR法，ATP酶法需要使用熒光分光光度計(jì)，且商品化的支原體檢測(cè)試劑盒價(jià)格昂貴，大面積推廣使用成本較高，作者通過比較實(shí)時(shí)熒光定量PCR、和ATP酶法可以看出，基于核酸擴(kuò)增檢測(cè)支原體的方法在其靈敏度和準(zhǔn)確性上仍是支原體快速篩選檢測(cè)的首要手段。

恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)因其操作簡(jiǎn)單、儀器控溫容易實(shí)現(xiàn)已作為微生物快速檢驗(yàn)的最重要的手段之一。目前在工業(yè)和科研領(lǐng)域最為常見的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)包括LAMP(Loop-mediated isothermal amplification method)和RPA（Recombinase polymerase amplification）。其中，RPA在擴(kuò)增時(shí)間、擴(kuò)增特異性、擴(kuò)增所需要的能耗等方面均具有明顯的優(yōu)勢(shì)。原理為通過反應(yīng)體系中通常為30-35個(gè)堿基的兩條特異性引物與重組酶形成復(fù)合物，在模板DNA上尋找同源序列發(fā)生鏈交換，并在DNA聚合酶作用下發(fā)生延伸。經(jīng)過上下游引物在模板的特異性區(qū)段兩端分別結(jié)合延伸，循環(huán)往復(fù)發(fā)生指數(shù)級(jí)擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物雖然可通過添加sybr Green染料實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)的增加，但因熒光染料無法區(qū)分非特異性，而通過反應(yīng)體系中增加可以被核酸外切酶III或者核酸內(nèi)切酶IV進(jìn)行堿基類似物切除的方式的特異性熒光探針技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，從而大大提高了檢測(cè)的特異性。目前RPA核酸檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)已應(yīng)用到農(nóng)業(yè)，獸醫(yī)，生物制藥等多個(gè)領(lǐng)域。Boyle等人研究發(fā)現(xiàn)RPA對(duì)于HIV-1的診斷是一個(gè)理想的技術(shù)，不需要復(fù)雜的溫度循環(huán)設(shè)備，在恒定溫度條件下20min內(nèi)可以完成目的基因的擴(kuò)增，對(duì)于HIV-1前病毒NDA檢測(cè)靈敏度可低至3個(gè)拷貝。目前RPA技術(shù)已經(jīng)在多個(gè)傳染病病原和微生物檢測(cè)領(lǐng)域得以廣泛的報(bào)道，如用于致病性支原體或是某種病毒等的檢測(cè)，但報(bào)道均為針對(duì)一種或完全同一類的病原進(jìn)行檢測(cè)，截止目前利用RPA技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞支原體污染的相關(guān)研究尚未見有報(bào)道。而支原體檢測(cè)需要跨不同的物種進(jìn)行檢測(cè)，并且從進(jìn)化樹親緣關(guān)系上，與支原體檢測(cè)需要包含的物種如萊氏無膽甾原體其基因序列和大腸桿菌同源性更高，需要排除大腸桿菌的干擾同時(shí)包含萊氏無膽甾原體。因此通過常規(guī)序列同源性分析，無法在上述兩條引物與探針之間設(shè)計(jì)特異性區(qū)段能夠在同源性上既能包括常見的支原體污染類型，又能排除大腸桿菌序列。

先達(dá)基因（gendx.cn）自主研發(fā)的ERA恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，通過酶工程改造，將來源于細(xì)菌和病毒的特定工具酶進(jìn)行改造突變并篩選其功能，通過不同的DNA擴(kuò)增反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化組合，從而獲得8種酶蛋白為核心的等溫?cái)U(kuò)增體系。配好的反應(yīng)體系在各種實(shí)時(shí)熒光定量?jī)x或者先達(dá)基因自主研發(fā)的簡(jiǎn)易恒溫?zé)晒鈾z測(cè)儀中，可實(shí)現(xiàn)恒溫?cái)U(kuò)增與熒光信號(hào)檢測(cè)于一體，通過實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增曲線在20min內(nèi)就可通過檢測(cè)儀的顯示屏讀出檢測(cè)結(jié)果，檢測(cè)過程無需開蓋，避免氣溶膠的產(chǎn)生，結(jié)果可靠性大幅度提高。ERA結(jié)合先達(dá)基因提供的一步法提取DNA的試劑，進(jìn)一步簡(jiǎn)化了支原體檢測(cè)操作，5min完成細(xì)胞液的DNA提取，20min完成支原體DNA分子檢測(cè)，整個(gè)過程只需30min。

ERA中的擴(kuò)增酶具有較強(qiáng)的錯(cuò)配容忍性，而針對(duì)3’末端的錯(cuò)配將大大影響擴(kuò)增的效率。通過在探針序列中，在堿基類似物兩端待排除序列引入錯(cuò)配，從而通過特異性擴(kuò)增的引物及和特異性剪切的探針組合，達(dá)到擴(kuò)增特異性的檢驗(yàn)?zāi)康�。基于以上原則設(shè)計(jì)ERA上下游引物，引物在3’末端與大腸桿菌至少有一個(gè)堿基的錯(cuò)配，但與所有支原體3’末端并無錯(cuò)配，雖然在5’端與中間有個(gè)別堿基錯(cuò)配，但并不影響其擴(kuò)增；并設(shè)計(jì)特異性的探針區(qū)段，在堿基類似物兩端在待排除序列引入錯(cuò)配，從而通過特異性擴(kuò)增的引物及和特異性剪切的探針組合。

綜上所述，截止目前很多支原體檢測(cè)方法已被開發(fā)出來，并多種檢測(cè)試劑盒可供選擇，但是這些方法或是因?yàn)槊舾行圆钊菀壮霈F(xiàn)假陰性結(jié)果，或是因?yàn)闄z測(cè)范圍小不能檢測(cè)到所有的支原體污染，或是因?yàn)樵囼?yàn)周期長(zhǎng)費(fèi)時(shí)費(fèi)力。先達(dá)基因研發(fā)的恒溫廣譜支原體檢測(cè)試劑盒，基于其實(shí)時(shí)熒光恒溫核酸檢測(cè)技術(shù)（ERA），可以在恒定的低溫下（25℃-42℃）對(duì)痕量的支原體種內(nèi)保守性DNA片段進(jìn)行特異性的擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)可以在20min內(nèi)完成，實(shí)現(xiàn)了快速簡(jiǎn)單靈敏的進(jìn)行細(xì)胞支原體常規(guī)檢測(cè)，較其他的方法更加實(shí)用有效。