摘要：細(xì)胞死亡是一個重要的生物過程，其檢測和測量過程困難，尤其是在多種檢測條件同時進行時。由于測量技術(shù)的復(fù)雜性和該領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)化方法的缺乏，細(xì)胞死亡數(shù)據(jù)的解讀變得更加復(fù)雜。本文提供更多提示來幫助解釋細(xì)胞死亡實驗。
 

關(guān)鍵詞：細(xì)胞死亡、數(shù)據(jù)解讀、細(xì)胞增殖、細(xì)胞死亡機制、細(xì)胞分析、細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞計數(shù)、活細(xì)胞成像
 

《Nature Cell Biology》期刊在2023年11月發(fā)表了一篇名為《Quick tips for interpreting cell death experiments》^[1]的文章，文中列舉了解讀細(xì)胞死亡實驗結(jié)果的多個技巧。

細(xì)胞死亡是動物發(fā)育和維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要的環(huán)節(jié)，許多研究試圖了解細(xì)胞死亡是如何被調(diào)節(jié)的，也有研究試圖找到能夠觸發(fā)或防止細(xì)胞死亡的藥物。測量細(xì)胞死亡并清楚地呈現(xiàn)細(xì)胞死亡過程是一個艱巨的挑戰(zhàn)。這篇綜述提供了一些技巧來幫助解釋已發(fā)表的細(xì)胞死亡實驗的結(jié)果。重點在于培養(yǎng)細(xì)胞中進行的機制實驗，在兩種或兩種以上的條件下比較細(xì)胞死亡的數(shù)量，這是許多研究中常見的實驗方式。這些技巧是根據(jù)作者自己的研究、所遇到的問題和失誤，以及盡可能仔細(xì)地測量細(xì)胞死亡而做出的努力得出的。
 

Tip1：如何檢測細(xì)胞死亡

活細(xì)胞、瀕死細(xì)胞和死細(xì)胞都會產(chǎn)生許多信號，通過這些信號可直接檢測或間接推斷細(xì)胞死亡（圖1a，b），重要的是要注意不同技術(shù)是如何檢測細(xì)胞死亡的。例如，使用流式細(xì)胞術(shù)或圖像法直接對群體中的單個活細(xì)胞和/或死細(xì)胞進行計數(shù)。然而，許多研究中用來推斷細(xì)胞死亡的依據(jù)是群體中所有細(xì)胞獲得的大量代謝物，例如還原四唑基化合物（如使用MTT試劑盒）或測量總ATP豐度（如使用CellTiter-Glo）。雖然代謝數(shù)據(jù)相對簡單且易于拓展到大量樣品，但這些方法不能直接測量細(xì)胞死亡且會受到技術(shù)干擾（例如在細(xì)胞凋亡早期，線粒體損傷會改變新陳代謝、增加ATP水平，與細(xì)胞死亡無關(guān)^[2]），在進行這些操作時，減緩新陳代謝但不殺死細(xì)胞的情況也可能引起誤解。監(jiān)測細(xì)胞死亡途徑特異性生化變化（如凋亡過程中線粒體內(nèi)膜跨膜電位的喪失）可能有助于分析細(xì)胞死亡機制的誘發(fā)情況，但仍會受到其他限制，下文將進行解析。

 

Tip2：如何分析細(xì)胞死亡

細(xì)胞死亡研究的常見比較方法是陰性對照與一種或多種處理條件之間進行對比（圖1c）。如上文所述，需要注意的是監(jiān)測細(xì)胞死亡還是推斷細(xì)胞死亡。在使用大量代謝物進行檢測時，無法辨別治療處理是否會導(dǎo)致細(xì)胞死亡、減緩細(xì)胞增殖或?qū)е逻@些效應(yīng)的某種組合情況發(fā)生（圖1d），當(dāng)長時間處理細(xì)胞時這一問題尤為突出，持續(xù)增殖、增殖停止或細(xì)胞死亡的綜合情況可能會發(fā)生。此外，只知道活細(xì)胞數(shù)或死細(xì)胞數(shù)難以了解藥物效果，例如，一個樣本起初有100個活細(xì)胞，后來有100個死細(xì)胞和0個活細(xì)胞，這與一個樣本起初有100個活細(xì)胞，后來有100個死細(xì)胞和400個活細(xì)胞是不同的。我們需要知道在實驗開始時的活細(xì)胞數(shù)以及在實驗結(jié)束時的活細(xì)胞數(shù)和死細(xì)胞數(shù)，才能清楚地了解特定治療的效果^[3,4]。

 

Tip3：考慮時間對結(jié)果的影響

細(xì)胞死亡是隨時間推移而發(fā)生的過程，在最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡信號到達和實際質(zhì)膜破裂之間通常會發(fā)生一段信號轉(zhuǎn)導(dǎo)期，這個時間可以從幾分鐘、幾小時、或到幾天不等，這是致命刺激的性質(zhì)^[5]（圖1d）影響而造成的。因此，重要的是要注意何時進行細(xì)胞死亡測量。通常會使用一個任意的終點（例如，6、24或48小時）。重要的是要考慮終點的選擇是否有生物學(xué)依據(jù)，以及如果提前或推遲測量結(jié)果會是怎樣。某些細(xì)胞死亡抑制劑或基因操作可能并不能完全阻止細(xì)胞死亡，而只是改變了細(xì)胞死亡的時間^[3]。因此，理想情況下細(xì)胞死亡是隨著時間的推移而測量的。在采用終點檢測法時，合理選擇時間點至關(guān)重要。

在質(zhì)膜破裂后的某個時刻，原始細(xì)胞物質(zhì)可能會完全解體（圖1a），這可能將導(dǎo)致對細(xì)胞死亡的誤解。相對于細(xì)胞群中細(xì)胞死亡的開始時間而言，過晚地測量可能意味著只有少量死亡細(xì)胞能保持足夠的完整性，無法通過任何方式對其進行計數(shù)。如果一種擾動迅速殺死了一些細(xì)胞，但剩余的活細(xì)胞繼續(xù)增殖直到較晚的實驗終點，這可能會掩蓋早期的細(xì)胞死亡效應(yīng)，并導(dǎo)致一種“幸存者偏差”，即特定處理的致死效應(yīng)被忽視。對群體中的細(xì)胞死亡進行延時測量有助于改善這些問題^[3,4]。

 

Tip4：考慮細(xì)胞增殖對數(shù)據(jù)解釋的影響(第一部分)

特別是在使用終點法測定細(xì)胞活力時，細(xì)胞增殖可能會影響對細(xì)胞死亡的檢測和解釋。^[6]在對照條件下的活細(xì)胞數(shù)量通常會在實驗開始和結(jié)束之間會迅速增加。在已發(fā)表的研究中頻繁使用24或48小時作為時間終點的部分原因是需要在這些細(xì)胞本身密度過大導(dǎo)致細(xì)胞死亡之前從對照條件中捕獲數(shù)據(jù)(圖1d)。更重要的是，相對于任何處理過的細(xì)胞群體，對照細(xì)胞群體的無限增殖可能無意中導(dǎo)致被誤解為對細(xì)胞死亡的影響(圖1d)^[7]。

 

細(xì)胞增殖不會因許多致命的刺激而停止，在細(xì)胞死亡開始前的幾個小時內(nèi)，活細(xì)胞的數(shù)量反而會繼續(xù)增加(圖1d)^[3]。另一方面，DNA損傷或生長因子信號的抑制可引起雙相反應(yīng)，即細(xì)胞首先停止增殖，之后不再增殖的細(xì)胞發(fā)生死亡^[8]。這些動態(tài)很難用任何類型的終點分析來捕捉且不能輕易區(qū)分增殖停止和細(xì)胞死亡的大量代謝。隨著時間的推移，直接計數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞的技術(shù)可以幫助捕捉這些效應(yīng)，并將細(xì)胞死亡歸一化到一個群體中觀察到的起始或max活細(xì)胞數(shù)^[3,4]。還開發(fā)了一些特殊的指標(biāo)來衡量細(xì)胞增殖和細(xì)胞死亡是如何協(xié)調(diào)的，并有助于解釋群體水平上的細(xì)胞死亡^[7]。

 

Tip5：考慮細(xì)胞增殖對數(shù)據(jù)解釋的影響(第二部分)

同時檢查一種處理對許多不同細(xì)胞系的影響是非常常見的。細(xì)胞系之間細(xì)胞增殖速率的差異會很大程度地影響對這些數(shù)據(jù)的解釋。尤其在批量測定細(xì)胞活力時，相比于增殖較快的細(xì)胞，生長較慢的細(xì)胞通常對治療誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡表現(xiàn)出更強的抵抗力。HER2陽性乳腺癌細(xì)胞往往比培養(yǎng)的其他乳腺癌細(xì)胞增殖得更慢，因此傳統(tǒng)的測量方法無法捕捉到這些細(xì)胞對HER2抑制劑的獨特敏感性。歸一化方法可以減輕生長速率變化的混雜效應(yīng)，更準(zhǔn)確地測量處理因素誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡^[8,9]。

 

Tip6：數(shù)據(jù)規(guī)范化

細(xì)胞活力或細(xì)胞死亡通常以標(biāo)準(zhǔn)化和簡化的模式呈現(xiàn)（例如0到1或0%到100%的細(xì)胞死亡）。當(dāng)使用大量代謝物計算時，通常減去培養(yǎng)基或培養(yǎng)容器產(chǎn)生的背景信號來對結(jié)果進行歸一化處理，然后將實驗組與陰性對照組進行比對。“細(xì)胞活力”降低50%可能表示所有細(xì)胞的增殖速度減慢50%，也可能表示群體中某些細(xì)胞死亡而其他細(xì)胞存活并增殖。

 

在一些研究中，結(jié)果被進一步抽象為相對于對照組的“細(xì)胞死亡百分比變化”。如果沒有進一步的信息，就無法獲知細(xì)胞群中多少細(xì)胞死亡。“細(xì)胞死亡增加100%”可以解釋為2%和4%的死亡細(xì)胞之間的差異，也可能意味著40%和80%的死亡細(xì)胞之間的差異。這種形式的數(shù)據(jù)歸一化可能會影響我們對生物效應(yīng)的判斷。其他的簡化方法，如以熱圖形式顯示匯總數(shù)據(jù)，可以簡明扼要地傳達許多觀測值。這些描述只顯示了平均值，不同條件下存在的生物變異性仍不清楚。有時，應(yīng)用的歸一化和簡化程度越多，就越難直觀地理解一種處理方法如何影響細(xì)胞死亡。

 

Tip7：仔細(xì)檢查圖表標(biāo)注

細(xì)胞死亡數(shù)據(jù)結(jié)果的呈現(xiàn)方式會影響我們對這些結(jié)果的解讀。細(xì)胞死亡分析通常以x-y圖的形式呈現(xiàn)，其中y軸是“細(xì)胞死亡”的某種測量值。衡量標(biāo)準(zhǔn)可能包括活細(xì)胞計數(shù)、死細(xì)胞計數(shù)、群體中檢測到的細(xì)胞死亡標(biāo)記物的數(shù)量或群體代謝活動。需要特別注意這些不同類型的數(shù)據(jù)在y軸是如何標(biāo)注的，尤其是來自不同檢測方法的數(shù)據(jù)被歸一化并轉(zhuǎn)換成“細(xì)胞死亡百分比”或“細(xì)胞存活百分比”值時。如上所述，大量代謝物讀數(shù)并不直接體現(xiàn)細(xì)胞死亡情況，但有時會被作為細(xì)胞死亡的衡量標(biāo)準(zhǔn)。同樣，僅對細(xì)胞死亡或死細(xì)胞情況進行定量也不一定能有效說明群體中細(xì)胞死亡的總體水平。理想情況下，y軸應(yīng)標(biāo)注實際的測量值，以避免數(shù)據(jù)被過度解讀或誤讀的風(fēng)險。此外，y軸的范圍也很重要，有時y軸不是呈現(xiàn)一個完整的范圍（0-100%），而是被限制在一組有限的值之間，這往往會在視覺上放大差異。

 

Tip8：注意細(xì)胞菌株和細(xì)胞培養(yǎng)條件

細(xì)胞供應(yīng)源、傳代數(shù)和生長條件是細(xì)胞死亡實驗中的重要變量。培養(yǎng)中的細(xì)胞在不斷變化，這種變化可能導(dǎo)致不同實驗室使用的同一細(xì)胞系菌株之間細(xì)胞死亡的差異[9]。細(xì)胞死亡反應(yīng)也會因生長培養(yǎng)基成分、細(xì)胞數(shù)量或培養(yǎng)容器中的細(xì)胞匯合度不同而存在差異。因此，關(guān)注上述變量至關(guān)重要。在某些情況下，實驗之間、實驗室之間的結(jié)果差異可以用細(xì)胞系克隆漂移、檢測細(xì)胞融合差異及細(xì)胞生長條件來解釋^[11,12]。雖然細(xì)胞死亡數(shù)據(jù)的報告程序在不斷改進，但是存在的變量以及差異并不是一直出現(xiàn)在所公布的方法內(nèi)。

 

Tip 9：關(guān)注效應(yīng)量和可重復(fù)性

可重復(fù)性是生物學(xué)研究中的重大難題。即使是相對簡單的實驗設(shè)計，也包含數(shù)十個潛在的誤差來源，這些誤差來源與原材料、試劑、細(xì)胞培養(yǎng)和接種條件、移液器校準(zhǔn)等有關(guān)^[13]。即使盡可能使用相同的試劑和實驗方案，不同實驗室的細(xì)胞存活率實驗結(jié)果仍然會有差異^[11]。 重要的是要考慮到，在細(xì)胞死亡研究中，實驗誤差或隨機誤差可能是造成不同條件下觀察到差異的原因。

 

結(jié)果可重復(fù)性是避免誤差的一道重要防線。在細(xì)胞生物學(xué)和動物研究中，實驗可重復(fù)性究竟是什么呢？已發(fā)表的研究報告在這一點上并不明確。有些研究認(rèn)為在多孔板的平行孔中同時進行的實驗是“獨立”的重復(fù)，這種方法節(jié)省了時間，但很大限度地降低了生物變異性和系統(tǒng)性產(chǎn)生的風(fēng)險。有時實驗會在不同時間出結(jié)果，但只有一個獨立實驗的數(shù)據(jù)會作為代表性數(shù)據(jù)顯示出來，這就很難評估其生物變異程度。

 

細(xì)胞和試劑即使來自同一動物或同一批次，在不同時間進行重復(fù)實驗也會存在類似的潛在混淆風(fēng)險。因此需謹(jǐn)慎對待規(guī)模較小、在獨立實驗中未重復(fù)且僅在一種環(huán)境中得到驗證的細(xì)胞死亡。在一種細(xì)胞系中獲得的細(xì)胞死亡發(fā)現(xiàn)是否也能在另一種細(xì)胞系中獲得，以及獨立和正交的方法（如細(xì)胞死亡機制特異性標(biāo)記物的生化讀數(shù)和活細(xì)胞與死細(xì)胞成像計數(shù)）是否都指向相同的機制結(jié)論[14]也是關(guān)鍵問題之一。由兩個或更多個獨立研究小組得出的類似機制發(fā)現(xiàn)其可信度會更高，并且比僅在單個實驗室中獲得的任何結(jié)果更具有普遍性。

 

Tip 10：仔細(xì)評估細(xì)胞死亡機制

細(xì)胞死亡可以通過細(xì)胞凋亡或幾種非凋亡細(xì)胞死亡機制之一進行，這些機制并不容易區(qū)分。研究者有必要關(guān)注如何監(jiān)測不同的細(xì)胞死亡機制。細(xì)胞死亡機制特異性標(biāo)志物會報告一種細(xì)胞死亡機制的激活情況，但對可能同時發(fā)生的其他細(xì)胞死亡機制視而不見。我們漸漸深入發(fā)現(xiàn)了一些機制特異性細(xì)胞死亡標(biāo)志物。例如，磷脂酰絲氨酸結(jié)合Annexin V歷來被用作細(xì)胞凋亡的標(biāo)志物，但磷脂酰絲氨酸也可能暴露在經(jīng)歷壞死性凋亡和其他形式的非凋亡細(xì)胞死亡的細(xì)胞表面^[15]。在解釋使用機制特異性細(xì)胞死亡抑制劑獲得的結(jié)果時也需要謹(jǐn)慎，這可能會產(chǎn)生脫靶效應(yīng)。例如一些小分子具有獨立于蛋白質(zhì)結(jié)合的隱自由基捕獲抗氧化活性，可抑制鐵死亡^[16]。通過不斷完善和更新用于評估細(xì)胞死亡機制的標(biāo)準(zhǔn)，有可能更清晰地解釋現(xiàn)有數(shù)據(jù)和新數(shù)據(jù)。

 

與細(xì)胞死亡檢測相關(guān)的問題概述

a、活細(xì)胞、瀕死細(xì)胞和死細(xì)胞可以產(chǎn)生獨特的和可測量的信號。b、常見細(xì)胞活力和細(xì)胞死亡定量方法舉例。FLICK，基于熒光和裂解的細(xì)胞死亡動力學(xué)推斷；LDH，乳酸脫氫酶；MTT，3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide；PI，碘化丙啶；SPARKL，使用實時動力學(xué)標(biāo)記的單細(xì)胞和群體水平分析；STACK，可擴展的細(xì)胞死亡動力學(xué)延時分析。 c、多孔板中典型的細(xì)胞死亡檢測實驗設(shè)計示例。d、七種不同的變量和因素會影響細(xì)胞死亡實驗的解釋。在使用終點測量法和間接生化檢測法（如 ATP 總豐度或四氮唑還原強度）時，這些影響混淆數(shù)據(jù)解釋的可能性尤為嚴(yán)重。

 

那么有什么樣的工具可以有助于細(xì)胞死亡檢測呢？

 

奎克泰生物的EVE™和ADAM™系列自動細(xì)胞計數(shù)儀，操作簡單，快速區(qū)分活死細(xì)胞，計算細(xì)胞存活率！

 

奎克泰生物的JuLI™系列實時活細(xì)胞成像分析儀能夠放置于培養(yǎng)箱內(nèi)，對細(xì)胞進行實時觀察、拍攝記錄生長周期的全過程，在保證細(xì)胞生長環(huán)境穩(wěn)定的情況下，同時對細(xì)胞計數(shù)、拍照，形成視頻，分析融合度與生長曲線，提供細(xì)胞死亡量化結(jié)果！

 

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