在生物科學(xué)領(lǐng)域，基因沉默現(xiàn)象引起了科研人員極大的興趣�；�因沉默，顧名思義，是指通過特定手段使基因失去活性或降低其表達(dá)水平的過程。這一現(xiàn)象在生物體內(nèi)普遍存在，對于維持生命活動的穩(wěn)定以及應(yīng)對各種環(huán)境變化具有重要意義。本文將詳細(xì)介紹基因沉默的概念、常用技術(shù)和實(shí)驗(yàn)步驟，展望其應(yīng)用前景，以期幫助讀者更好地理解這一現(xiàn)象。 

 

一、基因沉默的概念

基因沉默主要指基因表達(dá)的抑制和沉默現(xiàn)象。在生物體內(nèi)，基因的表達(dá)受到嚴(yán)格調(diào)控，而基因沉默就是一種重要的基因表達(dá)調(diào)控方式。根據(jù)作用方式的不同，基因沉默可分為自然發(fā)生的基因沉默和人為操作的基因沉默。自然發(fā)生的基因沉默可通過多種因素實(shí)現(xiàn)，如DNA甲基化、異染色質(zhì)形成、轉(zhuǎn)錄后基因沉默（RNAi）等。而人為操作的基因沉默則可以通過基因敲除、轉(zhuǎn)錄因子抑制、表觀遺傳修飾等方法實(shí)現(xiàn)。

 

二、常用基因沉默技術(shù)

RNA干擾（RNAi）：RNAi技術(shù)利用雙鏈RNA（dsRNA）引發(fā)特異性mRNA的降解，從而降低或關(guān)閉目標(biāo)基因的表達(dá)。RNAi技術(shù)具有高效、特異性強(qiáng)、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，已成為研究基因功能和藥物篩選的重要工具。然而，該技術(shù)也存在一定的脫靶效應(yīng)和細(xì)胞毒性等問題。

化學(xué)沉默：化學(xué)沉默是指通過特定的化學(xué)抑制劑或藥物作用于細(xì)胞，干擾基因的表達(dá)或轉(zhuǎn)錄過程，從而實(shí)現(xiàn)基因沉默。常用的化學(xué)沉默藥物包括DNA甲基化抑制劑、組蛋白去乙酰化酶抑制劑等。這類方法的優(yōu)點(diǎn)是可以通過口服或注射給藥，直接作用于患者體液或組織，但對于作用機(jī)制和藥物劑量要求較高。

基因敲除：基因敲除技術(shù)通過同源重組或CRISPR-Cas9等手段，將目標(biāo)基因進(jìn)行部分或完全敲除。該技術(shù)具有較高的特異性和可操作性，但需要設(shè)計(jì)特異性的核酸酶，且存在一定的細(xì)胞毒性風(fēng)險(xiǎn)。

 

三、RNA干擾（RNAi）基因沉默技術(shù)的基本步驟

尋找目的基因：確定想要沉默的目標(biāo)基因，可以通過文獻(xiàn)研究、基因表達(dá)譜分析等方法來篩選。

設(shè)計(jì)并合成siRNA：根據(jù)目標(biāo)基因的序列，設(shè)計(jì)并合成能與目標(biāo)基因特異結(jié)合的短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）。shRNA在細(xì)胞內(nèi)被轉(zhuǎn)錄和表達(dá)后，會形成約21-23bp的siRNA。

轉(zhuǎn)錄和表達(dá)shRNA：將設(shè)計(jì)好的shRNA通過轉(zhuǎn)染或者其他方式轉(zhuǎn)入到細(xì)胞中，并在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和表達(dá)shRNA。

siRNA與目標(biāo)基因結(jié)合：轉(zhuǎn)錄后形成的siRNA在細(xì)胞內(nèi)與目標(biāo)基因結(jié)合，抑制目標(biāo)基因的表達(dá)。這一過程需要RNA解旋酶將siRNA雙鏈解開，反義鏈與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物RISC形成復(fù)合物，最終由siRNA互補(bǔ)結(jié)合靶RNA引導(dǎo)核酸酶切割，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默。

驗(yàn)證基因沉默效果：通過qRT-PCR、Western Blot等技術(shù)檢測目標(biāo)基因的表達(dá)水平，評估基因沉默效果。

這些步驟是RNAi基因沉默技術(shù)的基本流程，具體操作可能因?qū)嶒?yàn)室和研究需求而有所不同。

PS：
shRNA和siRNA在RNAi過程中具有密切關(guān)系。它們都是具有一定結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的RNA序列，在RNAi通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

siRNA是RNA干擾過程中觸發(fā)基因沉默的主要分子。在RNAi通路中，siRNA通過與互補(bǔ)mRNA分子雜交干擾基因表達(dá)。這種干擾會導(dǎo)致mRNA降解，進(jìn)而抑制特定基因的表達(dá)。

shRNA是siRNA的前體，由短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA）加工而來。shRNA的結(jié)構(gòu)由互補(bǔ)的兩條序列及l(fā)oop環(huán)組成。在形成siRNA的過程中，shRNA會被Dicer酶切割，生成21-23bp的siRNA。然后，siRNA會裝載到RISC復(fù)合物上，并與與其序列同源的靶mRNA結(jié)合，引導(dǎo)RISC復(fù)合物切割靶mRNA，從而觸發(fā)基因沉默。

總之，shRNA和siRNA在RNAi過程中具有密切關(guān)系，shRNA經(jīng)過加工生成siRNA，后者是觸發(fā)基因沉默的關(guān)鍵分子。

 

四、基因沉默RNAi試劑推薦

1. Dharmacon可提供的siRNA產(chǎn)品類型

1）ON-TARGETplus™ siRNA——全新的基因沉默標(biāo)準(zhǔn)，顯著降低脫靶效應(yīng)
基因沉默中最主要的脫靶效應(yīng)是由反義鏈中“seed region”活性引起的，一味地提高反義鏈的活性可能增加由反義鏈引起的脫靶。ON-TARGETplus ™在SMARTselection技術(shù)基礎(chǔ)上結(jié)合最新的功能性和特異性設(shè)計(jì)原則，并利用獨(dú)—無二的雙鏈修飾技術(shù)——結(jié)合正義鏈?zhǔn)Щ罴夹g(shù)和反義鏈seed region 修飾技術(shù)，同時(shí)減少由雙鏈引起的脫靶效應(yīng)，使得ON-TARGETplus™ siRNA的脫靶效應(yīng)降到最低。 

 

圖注：ON-TARGETplus™修飾減少了脫靶效應(yīng)，而SMARTpool進(jìn)一步減少了脫靶的數(shù)量

 

2）siGENOME™ siRNA——經(jīng)濟(jì)、可信的基因沉默工具
siGENOME™合理分析鏈偏好性，選擇合適靶點(diǎn)，同時(shí)選擇性使用ON-TARGET™技術(shù)保證沉默效率和低脫靶率。

 

3）Accell™ siRNA—史無前例的新武器，無需任何轉(zhuǎn)染試劑

• 極簡的操作方法：無需轉(zhuǎn)染試劑、電轉(zhuǎn)儀器或病毒載體即可完成高效siRNA投遞
• 創(chuàng)新的siRNA修飾專利方法，同時(shí)擁有高攝取率、高穩(wěn)定性、高特異性和高沉默效率
• 已在神經(jīng)細(xì)胞、免疫細(xì)胞、原代細(xì)胞等難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中成功應(yīng)用
• 特殊的穩(wěn)定性修飾，可直接應(yīng)用于體內(nèi)轉(zhuǎn)染
• 低細(xì)胞毒性，可對細(xì)胞持續(xù)使用，延長靶基因的沉默持續(xù)時(shí)間  

 

圖注：Accell™ siRNA 操作步驟

 

2. Dharmacon可提供的shRNA產(chǎn)品類型

1）GIPZ™慢病毒載體shRNA——模擬microRNA設(shè)計(jì)的shRNA，高效低毒，保證沉默效率

• Dharmacon針對人和小鼠的每個(gè)基因分別設(shè)計(jì)了多條shRNA，從而保證沉默效率
• TurboGFP報(bào)告基因和shRNA受同—啟動子啟動表達(dá)，監(jiān)測shRNA表達(dá)效果
• 可用于轉(zhuǎn)導(dǎo)原代細(xì)胞或非分裂細(xì)
• 提供甘油菌克隆及克隆set，可利用puromycin篩選穩(wěn)定細(xì)胞株 
      

 

GIPZ shRNA質(zhì)粒載體元件示意圖