無論用戶使用的是可溶性蛋白還是膜蛋白，都需要篩選和優(yōu)化眾多結(jié)晶條件，以找到合適的結(jié)晶條件。在脂質(zhì)立方相 (LCP) 中成功結(jié)晶的主要因素之一是蛋白質(zhì)在脂質(zhì)雙層內(nèi)擴散的能力。蛋白質(zhì)的擴散速率受蛋白質(zhì)聚集、LCP 的結(jié)構(gòu)特性和化學環(huán)境的影響。擴散速率可以通過光漂白后的熒光恢復(fù) (FRAP) 來確定，它測量標記蛋白的熒光強度在經(jīng)過光漂白的 LCP 液滴中的一小塊區(qū)域內(nèi)重新恢復(fù)所需的時間量（圖1）。用戶可以繪制和分析歸一化熒光強度與時間的曲線，以量化兩個與蛋白擴散相關(guān)的特性：遷移率（強度曲線漸近接近的值）和擴散速率（與曲線起點處的斜率成比例） 。

圖 1. 1) 以預(yù)漂白樣品圖像作為基線熒光強度；2) 樣品通過一個小的（~15 微米直徑）激光光斑進行光漂白。3) 隨著漂白分子向外擴散和新分子向內(nèi)擴散，監(jiān)測該漂白點內(nèi)的熒光強度。

自動化 LCP-FRAP 儀器最初由斯克里普斯研究所開發(fā)，現(xiàn)在由 FORMULATRIX® 生產(chǎn)，極大地加快了LCP 板的篩選過程。用戶使用 FRAP 進行篩選，無需等待數(shù)天到數(shù)周來確定晶體是否已形成， FRAP 給予了使用者即時觀察，以此判斷條件是否最適合結(jié)晶，同時排除那些由于擴散速率不高而不會形成結(jié)晶的條件。雖然整個 FRAP 過程仍然相對緩慢，每個蛋白液滴需要花 15-20 分鐘才能完成，但這樣需要的蛋白質(zhì)量相對較少。一種能夠避免每個 LCP-FRAP 樣本的數(shù)據(jù)采集時間過長的方法便是僅收集終態(tài)熒光強度。

FRAP 系統(tǒng)通過使用這種三點數(shù)據(jù)收集方法（圖 2），可以依次漂白所有 96 個孔，然后返回收集熒光恢復(fù)圖像。雖然這種方法只能恢復(fù)樣本的遷移率，但研究人員仍然能夠僅依靠遷移率分析來識別潛在的結(jié)晶樣本。

圖 2. 高通量 FRAP 方法僅用于收集最終狀態(tài)熒光強度以確定樣本遷移率結(jié)果。

利用圖 3 所示的工作流程，F(xiàn)ORMULATRIX 的 RockImager-FRAP 可以在 50 分鐘內(nèi)完成 96 孔 FRAP 數(shù)據(jù)采集。

圖 3. 高通量 LCP-FRAP 數(shù)據(jù)采集流程圖

整塊結(jié)晶板的 FRAP 遷移率數(shù)據(jù)可以分組到具有顏色編碼背景的畫布視圖中，以便用戶快速識別結(jié)晶孔（圖 4）。然后，研究人員可以與軟件進行交互，將孔標記為結(jié)晶或非結(jié)晶。在大多數(shù)情況下，僅遷移恢復(fù)數(shù)據(jù)就足以讓研究人員識別潛在的結(jié)晶生成條件。盡管如此，人們可能仍希望生成完整的恢復(fù)曲線來檢查曲線形狀并確定擴散速率。為避免通過完全恢復(fù)運行所有 96 個樣本，此過程僅適用于用戶在三點高通量 FRAP 分析期間指定的那些潛在結(jié)晶生成孔。

圖 4. 收集的 FRAP 遷移率數(shù)據(jù)顯示在畫布視圖中，顏色編碼用于快速識別有無結(jié)晶生成可能。

可以繪制完整的強度恢復(fù)曲線并用貝塞爾函數(shù)擬合以得出擴散速率和恢復(fù)時間。在大多數(shù)情況下，單個 Bessel 函數(shù)足以實現(xiàn)低殘差擬合結(jié)果。在其余的大多數(shù)情況下，兩種不同類型的分子同時擴散。這通常是因為蛋白質(zhì)沒有被充分純化，而脂質(zhì)和蛋白質(zhì)分子都被熒光染料標記。較小分子量的脂質(zhì)比大蛋白質(zhì)分子擴散得快得多。在這種情況下，必須使用雙分量 Bessel 函數(shù)擬合來準確模擬兩種不同的擴散速率。