多重?zé)晒饷庖呓M化技術(shù)原理和流程及其應(yīng)用實(shí)例
多重?zé)晒饷庖呓M化技術(shù)(Multiplex immunohistochemical，mIHC) 也稱作酪氨酸信號放大 (Tyramide dignal amplification，TSA) 技術(shù)，是一類利用辣根過氧化酶(Horseradish Peroxidase, HRP) 對靶蛋白或核酸進(jìn)行高密度原位標(biāo)記的酶學(xué)檢測方法。
該方法基于酪胺信號放大的多重順次免疫染色技術(shù)，允許同時檢測單個細(xì)胞或組織樣本上的多個目標(biāo)靶點(diǎn)，全面研究細(xì)胞組成、細(xì)胞功能和細(xì)胞間相互作用。
mIHC 實(shí)驗(yàn)原理及流程
TSA 技術(shù)采用 HRP 標(biāo)記的二抗，HRP 催化加入體系的 TSA 衍生熒光染料，生成活化熒光底物，活化底物可與抗原上的酪氨酸共價結(jié)合，將信號共價結(jié)合到抗原上。之后用熱修復(fù)洗去非共價結(jié)合的抗體，再換下一種一抗來第二輪孵育，換另一種熒光素底物，如此往復(fù)就可實(shí)現(xiàn)多重標(biāo)記。
mIHC 借助于不同的熒光染料標(biāo)記，通過多輪染色循環(huán)實(shí)現(xiàn)組織或細(xì)胞的原位多靶點(diǎn)染色[2]。
Tips：
原理：帶有染料標(biāo)記的底物酪胺 (T) 分子在過氧化氫氧化環(huán)境下，被抗體或探針固定的 HRP 轉(zhuǎn)化為具有短暫活性的中間狀態(tài) (T*)，然后被激活的中間態(tài)分子 (T*) 迅速與相接蛋白分子的富含電子區(qū)域 (酪氨酸殘基) 進(jìn)行穩(wěn)定的共價結(jié)合，未被標(biāo)記的酪胺分子將被洗脫，借此實(shí)現(xiàn)對抗原的特異性染色。由于相接的蛋白 (包括 HRP，抗體，目標(biāo)抗原) 都含有大量的酪氨酸結(jié)合位點(diǎn)，所以目標(biāo)抗原處會富集大量標(biāo)記分子，使信號被有效放大 (圖 2)。
■ IHC 與 mIHC
免疫組化，是應(yīng)用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原，對其進(jìn)行定位、定性的研究。
：簡單來說，mIHC 屬于 IHC 的升級版本！
Tips：相同點(diǎn)：能夠完整顯現(xiàn)組織原位形態(tài)信息。
不同點(diǎn)：
1. 常規(guī)免疫組化的分析屬于定性分析，其判斷大多依賴于經(jīng)驗(yàn)，其分析結(jié)果會有差異。而多重?zé)晒饷庖呓M化屬于定量分析，其利用軟件可對組織中的細(xì)胞進(jìn)行精準(zhǔn)的結(jié)果分析。
2. 常規(guī)免疫組化受傳統(tǒng)染色成像的限制，靶標(biāo)少于 3 個，無法完整分析組分信息。而多重?zé)晒饷庖呓M化可實(shí)現(xiàn)多因子共定位，可以獲取更多的生物信息，且樣本需求量較少。
圖 4. 癌組織單色 IHC（上）和多色譜 mIHC（下）驗(yàn)證[3]
■ mIHC 與 IF
那么問題來了，mIHC 與 IF 又有什么區(qū)別呢？既然最后的成像都是熒光圖像，那按照 IF 實(shí)驗(yàn)就行哇，為什么要去做 mIHC 呢？？？
：其實(shí)，mIHC 作為一種新型的免疫化學(xué)技術(shù)，其價值自然會優(yōu)于傳統(tǒng)的 IF 實(shí)驗(yàn)，并且二者在原理及操作步驟上均有差異。
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圖 3. mIHC（左）和常規(guī)三色熒光檢測示意圖（右）
應(yīng)用實(shí)例
■ 應(yīng)用一：腫瘤機(jī)制探究
Gang Wei 等人收集了透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌 (ccRCC) 患者的腎周脂肪 (Perinephric adipose tissue, PAT) 和皮下白色脂肪 ( White adipose tissue,WAT) 組織樣本，發(fā)現(xiàn)腫瘤鄰近脂肪細(xì)胞的解偶聯(lián)蛋白 1 (Uncoupling protein 1, UCP1) 表達(dá)高于遠(yuǎn)端脂肪細(xì)胞（WAT 褐變的典型特征之一是 UCP1 的表達(dá)上調(diào)）。
此外，腫瘤細(xì)胞的 qRT-PCR、mIHC 檢測和免疫印跡均表明，在聯(lián)合注射 BAC-shPgc1a或 BAC-shUcp1 相關(guān)的腫瘤中，脂肪細(xì)胞促進(jìn)的 UCP1 水平上調(diào)被抑制(圖 4)。
進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，ccRCC 細(xì)胞分泌甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白 PTHrP 以通過 PKA 激活促進(jìn) PAT 褐變，而 PAT 介導(dǎo)的產(chǎn)熱導(dǎo)致過量乳酸的釋放以增強(qiáng) ccRCC 的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移色[2]。
圖 4. UCP1 水平變化的檢測[4]
mIHC (A), qRT-PCR (BG) and Immunoblotting (C) 檢測 UCP1 水平。空白對照組：786-O; 陰性對照組：786-O+BAC-Scramble；敲低 Pgc1a 實(shí)驗(yàn)組：786-O+ BAC-shPgc1a；敲低Ucp1實(shí)驗(yàn)組：786-O+ BAC-shUcp1。
■ 應(yīng)用二：免疫抑制性腫瘤微環(huán)境鑒定
Halse, H 等人運(yùn)用 mIHC 對轉(zhuǎn)移性黑色素瘤中的免疫亞群進(jìn)行精準(zhǔn)定位，數(shù)據(jù)量化了腫瘤內(nèi) (Intra-tumor, IT) 與腫瘤基質(zhì) (Peri-tumoral, stroma) 的免疫亞群數(shù)量，以及免疫亞群與 (Tumor margin, TM) 的距離。
如圖所示，使用 mIHC 在特定腫瘤區(qū)域分析轉(zhuǎn)移性黑色素瘤中免疫亞群的精確位置，觀察不同免疫亞群在瘤內(nèi)的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，對于黑色素瘤的 MelTIL026 (盆腔淋巴結(jié)) 切片，大多數(shù) T 細(xì)胞為 CD4+T 細(xì)胞，且在腫瘤邊緣 (TM) 和間質(zhì)區(qū)域 (S) 突出，在腫瘤內(nèi) (IT) 區(qū)域 CD4+和 CD8+T細(xì)胞數(shù)量較少。
MCE 提供用于 mIHC 所需要的 Vari Fluor TSA 系列染料 ，可用于高密度原位標(biāo)記檢測。Vari Fluor TSA 系列通過辣根過氧化物酶 (HRP) 靶向抗原，基于酪胺的信號放大技術(shù)能夠提供極強(qiáng)的靈敏度、檢測極微量的目的抗原。熒光波長范圍較窄，可以很好的避免 mIHC 實(shí)驗(yàn)中的串色影響。
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貨號 |
產(chǎn)品名稱 | Ex/Em (nm) |
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Vari Fluor 350 TSA（200×） |
347/448 |
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Vari Fluor 488 TSA（200×） |
490/515 |
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Vari Fluor 532 TSA（200×） |
527/558 |
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Vari Fluor 555 TSA（200×） |
555/565 |
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Vari Fluor 594 TSA（200×） |
590/617 |
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Vari Fluor 640 TSA（200×） |
617/639 |
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| HY-D1831 | Vari Fluor 620 TSA（200×） | 617/639 |
| HY-D1833 | Vari Fluor 680 TSA（200×） | 617/639 |
| HY-D1839 | Biotin TSA（200×） | / |
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參考文獻(xiàn)
[1] Taube JM, et al. The Society for Immunotherapy of Cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) staining and validation [published correction appears in J Immunother Cancer. 2020 Jun;8(1):]. J Immunother Cancer. 2020;8(1):e000155.
[2] Tan WCC, et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Commun (Lond). 2020;40(4):135-153.
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[5] Halse H, et al. Multiplex immunohistochemistry accurately defines the immune context of metastatic melanoma. Sci Rep. 2018;8(1):11158. Published 2018 Jul 24.
