腫瘤壞死因子alpha（TNF-α）是一種由157個(gè)氨基酸組成的 17-kDa 蛋白質(zhì)，為免疫細(xì)胞產(chǎn)生的多功能細(xì)胞因子，在細(xì)胞凋亡和存活以及免疫和炎癥中發(fā)揮關(guān)鍵作用[1]。
 

它主要由活化的巨噬細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞和自然殺傷 (NK) 細(xì)胞分泌，但是在包括成纖維細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中也會(huì)有少量表達(dá)。腫瘤及其浸潤細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境 (TME) 中釋放的炎性介質(zhì)已被廣泛認(rèn)為是癌癥的標(biāo)志之一。有證據(jù)表明低濃度的促炎細(xì)胞因子表達(dá)與癌癥的嚴(yán)重程度以及不良預(yù)后相關(guān)。
 

TNF-α作為主要的炎性介質(zhì)已被發(fā)現(xiàn)在婦瘤、消化系統(tǒng)腫瘤、泌尿系統(tǒng)腫瘤以及血液瘤中表達(dá)。在 20 世紀(jì) 70 年代后期人們發(fā)現(xiàn)TNF-α即具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖，又具有誘導(dǎo)腫瘤生長的雙刃劍效應(yīng)[2]：他一方面可以通過誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡去抑制腫瘤細(xì)胞生長，但另一方面也刺激大多數(shù)對(duì)TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性具有抗性的癌細(xì)胞的增殖、存活、遷移和血管生成，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)展發(fā)生。
 

一，TNF-α信號(hào)通路

TNF-α 通過兩種不同的受體發(fā)揮作用[3]。
 

TNF受體1(TNFR-1) (p60) 在所有細(xì)胞類型上表達(dá)，而TNF受體2 (TNFR-2) (p80) 局限在免疫細(xì)胞中表達(dá)。盡管TNF-α 對(duì)TNFR-2的親和力比對(duì) TNFR-1高五倍，但TNFR-1才是啟動(dòng) TNF-α 大部分生物活性的關(guān)鍵[4]。兩種受體之間的主要區(qū)別在于只有TNFR-1即具有轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞存活信號(hào)的能力亦有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力，但這種生死信號(hào)調(diào)節(jié)的作用機(jī)制至今也未被透徹理解[5]。
 

如圖1所示，當(dāng)TNF-α與TNFR-1受體結(jié)合后，會(huì)招募TNFR相關(guān)死亡區(qū)域蛋白 (TRADD)，銜接蛋白受體相互作用蛋白（RIP），TNFR相關(guān)因子2 (TRAF-2)和Fas相關(guān)因子死亡區(qū)域蛋白 (FADD) [6]。而這些銜接蛋白負(fù)責(zé)進(jìn)一步細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)。當(dāng)TNFR-1 發(fā)出細(xì)胞凋亡信號(hào)時(shí)，F(xiàn)ADD被募集到復(fù)合物中，啟動(dòng)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞中DNA被切割，造成細(xì)胞凋亡[7]。當(dāng)TNFR-1發(fā)出生存信號(hào)時(shí)，TRAF-2被募集到復(fù)合物中，在一系列蛋白酶激活后，通過細(xì)胞質(zhì)凋亡蛋白抑制劑抑制細(xì)胞凋亡(cIAP)[8]。
 

而TRAF-2及RIP主要參與TNF誘導(dǎo)的 NF-κB 激活，而 NF-κB的靶基因以及其誘導(dǎo)的抗氧化錳超氧化物歧化酶 (MnSOD) 均被發(fā)現(xiàn)可以抑制細(xì)胞凋亡，在細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵作用，也同樣促進(jìn)癌細(xì)胞的生長[9]。

二，TNF-α造成的腫瘤殺傷

TNF 在1975年被發(fā)現(xiàn)并于1984年成功克隆，因其高濃度注射到小鼠移植肉瘤中可以誘導(dǎo)腫瘤壞死而得名[10]。這種現(xiàn)象后被證實(shí)與 TNF 連接 TNFR1 時(shí)可以觸發(fā)腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的能力相關(guān)[11]。但由于TNF治療引發(fā)的高毒副作用，很長時(shí)間無法在臨床上應(yīng)用，直到兩個(gè)研究小組發(fā)現(xiàn)將高濃度的 TNF 灌注到黑色素瘤或肉瘤患者的孤立肢體上可以造成細(xì)胞殺傷且降低TNF治療帶來的不良反應(yīng)[12]。
 

這些研究使得TNF的應(yīng)用策略轉(zhuǎn)變?yōu)獒槍?duì)腫瘤細(xì)胞毒性的增強(qiáng)。例如一項(xiàng)在小鼠黑色素瘤和淋巴瘤模型中證明基因工程改造的TNF能夠通過抗腫瘤血管生成來抑制腫瘤生長[13]；另一項(xiàng)研究證明對(duì)小鼠黑色素瘤內(nèi)注射TNF和 IL-2 編輯的溶瘤病毒也增強(qiáng)了PD-1 抑制劑的療效[14]。
 

但TNF 對(duì)免疫激活的直接影響在多數(shù)情況下都是有限的，最近的一項(xiàng)動(dòng)物研究表明，在過繼性T細(xì)胞轉(zhuǎn)移療法（ACT）中，由CD4+ T細(xì)胞產(chǎn)生的TNF只有與化療藥物聯(lián)用時(shí)才能對(duì)小鼠的淋巴瘤，結(jié)直腸癌以及乳腺癌造成腫瘤殺傷[15]，因此抗原特異性 CD4+ T 細(xì)胞產(chǎn)生的TNF和化療抑制小鼠腫瘤且延長其生存的必備條件。
 

這些研究表明，即使在大量抗原特異性T細(xì)胞可以到達(dá)腫瘤的情況下，他們產(chǎn)生的TNF水平仍不足以殺死腫瘤細(xì)胞。目前TNF-α在腫瘤治療的發(fā)展方向多以重組形式與化療聯(lián)合用于肢體隔離熱灌注術(shù)（ILP）為主[16]。重組TNF-α在 ILP 中可以直接抑制腫瘤生長，且增加化療藥物對(duì)腫瘤組織的滲透。
 

因此TNF-α在治療腫瘤領(lǐng)域的發(fā)展方向多以作為促進(jìn)劑而非直接參與腫瘤治療，目的是利用該藥物增加藥物輸送能力，因?yàn)檫@種細(xì)胞因子在腫瘤內(nèi)的選擇性靶向以及毒性管理仍是待探究的問題。
 

三，TNF-α造成的腫瘤生長

F.Balkwill 教授是第一個(gè)直接將TNF與腫瘤生長聯(lián)系起來的，他觀察到在小鼠皮膚癌變模型中，TNF、TNFR1 和 TNFR2 的缺失可以顯著減少乳頭狀瘤的發(fā)展。目前已被證實(shí)在較低區(qū)間內(nèi)的高水平TNF-α表達(dá)會(huì)促進(jìn)腫瘤生長。在B16小鼠黑色素瘤模型中，癌細(xì)胞分泌的TNF 促進(jìn)了腫瘤對(duì)骨髓細(xì)胞的浸潤以及內(nèi)皮標(biāo)志物的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤血管化和進(jìn)展[17]。而體內(nèi)研究表明使用靶向抗體阻斷 TNF/TNFR1 信號(hào)通路能夠增加微環(huán)境中黑色素瘤特異性 CD8+ T 細(xì)胞的比例并延緩腫瘤生長[18]。
 

另外，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)TNF還可以影響癌細(xì)胞的分化。在接受 ACT 治療的黑色素瘤患者中觀察到TNF誘導(dǎo)腫瘤分化過程，減少黑色瘤生物標(biāo)記物、降低免疫原性，促進(jìn)腫瘤復(fù)發(fā)[19]。
 

一項(xiàng)納入40例浸潤性乳腺癌患者前瞻性研究對(duì)比了患者血液樣本與30例相同年齡的健康女性血液樣本。研究表明浸潤性乳腺癌患者血清TNF-α平均值為1.47±0.58 pg/ml，比對(duì)照組的0.98±0.37 pg/ml顯著升高（P < 0.01）。且單變量分析顯示在腫瘤最大直徑≥5cm（P=0.03），TNM分期更晚（P<0.01）以及更晚期的淋巴結(jié)狀態(tài) (P < 0.01) 的患者中血清TNF-α顯著升高[20]（表1）。而在包括了肺癌和腎細(xì)胞癌的其他癌癥模型中也觀察到 TNF 參與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化 (EMT)，誘導(dǎo)腫瘤分化從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生[21-22]。
 

表1：與臨床病理變量相關(guān)的 TNF-α 血清濃度

總之，在癌癥進(jìn)展過程中，TNF 不僅可以通過直接調(diào)節(jié)白細(xì)胞的活化、功能和存活去降低免疫療法的效果，還可以改變癌細(xì)胞的表型，使它表達(dá)免疫抑制分子以及對(duì) T 細(xì)胞不可見，幫助免疫逃逸。
 

四，TNF-α對(duì)肝細(xì)胞癌的影響

肝細(xì)胞癌 (HCC) 是一種與炎癥相關(guān)的疾病。HCC 的發(fā)展和進(jìn)展受遺傳、表觀遺傳和環(huán)境因素的影響。乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）是HCC 最普遍的危險(xiǎn)因素之一。大約 70%-80% 的 HCC 與持續(xù)性病毒感染有關(guān)。
 

而巨噬細(xì)胞分泌的TNF-α作為一種促炎細(xì)胞因子，在惡性疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。一項(xiàng)大鼠動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn) TNF-α直接參與HPC的激活，而HPC的激活通常與肝損傷的組織修復(fù)相關(guān)。因此TNF-α抑制和缺失可以通過增加肝細(xì)胞凋亡和減少肝細(xì)胞增殖來降低腫瘤發(fā)生率[23]（圖2）。
 

而另一項(xiàng)收集了120例肝細(xì)胞癌患者的研究將臨床診斷分為復(fù)發(fā)組和未復(fù)發(fā)組以觀察IHC檢測(cè)的TNF-α表達(dá)，結(jié)果顯示復(fù)發(fā)組TNF-α表達(dá)水平顯著高于未復(fù)發(fā)組[24]。(0.25±0.01 vs 0.15±0.01, P<0.001,圖3A). 另外分析肝門區(qū) p-STAT3 表達(dá)與腫瘤周圍組織 TNF-α之間的關(guān)系表明這兩組之間存在顯著正相關(guān)（P<0.01，r=0.452，圖 3B）。因此TNF-α與促進(jìn)腫瘤生長以及導(dǎo)致HCC的不良預(yù)后息息相關(guān)。
 

圖2：A 和 B. 免疫熒光染色顯示，EpCAM (A) 和 OV6 (B) 陽性在肝門區(qū)域的表達(dá)均因 DEN 處理（移植HCC細(xì)胞小鼠）而增加，而 DEN+TNFR2-FcV組（移植HCC細(xì)胞但同時(shí)做TNF抑制處理）的兩種標(biāo)記物水平較低，這表明 HPC 激活可能需要 TNF-α。
 

圖3：A. IHC檢測(cè)的瘤周組織TNF-α表達(dá)，結(jié)果顯示復(fù)發(fā)組TNF-α表達(dá)水平高于未復(fù)發(fā)組。B.隨著腫瘤周圍組織中 TNF-α 表達(dá)的增加，肝門區(qū)的 p-STAT3 表達(dá)增加。

五，高TNF-α表達(dá)影響肝癌靶向藥療效

體外實(shí)驗(yàn)表明TNF-α通過誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）促進(jìn)肝癌細(xì)胞對(duì)索拉非尼耐藥。且目前的研究表明索拉非尼對(duì) TNF-α 的表達(dá)和分泌沒有顯著影響，無法逆轉(zhuǎn)高 TNF-α 表達(dá)對(duì)于HCC 細(xì)胞中EMT誘導(dǎo)作用。
 

一項(xiàng)納入 62 例HCC患者術(shù)后介紹索拉非尼輔助治療的研究中分析了 TNF-α表達(dá)與預(yù)后的相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)高 TNF-α表達(dá)的HCC患者無復(fù)發(fā)生存期及總生存期均較低TNF-α表達(dá)的HCC患者更短[25]。
 

圖4:Kaplan-Meier 分析表明具有較低 TNF-α表達(dá)的 HCC 患者總生存期和無復(fù)發(fā)生存期均較差(n=62)

六，淫羊藿素軟膠囊可降低TNF-α表達(dá)

淫羊藿素軟膠囊為傳統(tǒng)中藥材提取的黃酮類化合物，是擁有全球自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的1.2類中藥創(chuàng)新藥，是一種新型的小分子免疫調(diào)節(jié)劑。它獨(dú)特的雙通道免疫調(diào)節(jié)機(jī)制可以：1.通過抑制JAK2和STAT3磷酸化抑制IL-6/JAK2/STAT3信號(hào)通路，下調(diào)IL-6及TNF-α水平；2.通過直接結(jié)合MyD88/IKKα，抑制TLR- MyD88-IKK-NFκB信號(hào)通路，從而減少TNF-α、IL-6等因子產(chǎn)生，進(jìn)一步下調(diào)IL-6/JAK2/STAT3信號(hào)通路，兩條通路相輔相成，通過調(diào)節(jié)體內(nèi)促炎性因子水平來調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境。而TNF-a 與 IFN-γ是作為綜合生物標(biāo)志物評(píng)分（CBS，composite biomarker score）中的兩個(gè)細(xì)胞因子，也和其他標(biāo)志物共同參與到阿可拉定 II-III 期臨床研究中的 HCC 療效預(yù)測(cè)部分。
 

研究表明，在富集人群中(滿足以下檢測(cè)指標(biāo)的至少兩項(xiàng)：①AFP ≥ 400ng/mL ②TNF-α＜2.5 pg/mL ③IFN-γ ≥ 7.0pg/mL。)，淫羊藿素組的中位總生存期為13.54個(gè)月，Harzard ratio為 0.43，死亡風(fēng)險(xiǎn)比對(duì)照組降低57%。獨(dú)立影像學(xué)評(píng)估的試驗(yàn)組患者中位至疾病進(jìn)展中位時(shí)間也比對(duì)照組延長了近一倍，為3.65個(gè)月，中位無進(jìn)展生存期為2.79個(gè)月。且不良反應(yīng)發(fā)生率極低，3級(jí)以上總不良反應(yīng)發(fā)生率不到10%。根據(jù)該III其研究結(jié)果，淫羊藿素軟膠囊被2022版CSCO肝癌診療指南推薦用于晚期肝癌的治療（１B類證據(jù)），且對(duì)于肝功能較差的患者中獲得了CSCO指南的Ⅰ級(jí)推薦（1B類證據(jù)）。
 

七，逐典腫瘤壞死因子alpha（TNF-α）特點(diǎn)：

1.高純度；2.高特異性；3.無動(dòng)物源（AOF）；4.GMP級(jí)別；5.無His標(biāo)簽

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：

SDS-PAGE鑒定和SEC-HPLC純度：還原的SDS-PAGE 未見雜蛋白（左）；SEC-HPLC顯示高純度大于 98%，無聚集體產(chǎn)生（右）
 

SDS-PAGE鑒定和SEC-HPLC純度圖

應(yīng)用案例：

TNF-α活性：

在放線菌素D存在下通過鼠L929細(xì)胞的細(xì)胞溶解測(cè)定的ED 50 ≤ 0.05 ng/ml，對(duì)應(yīng)比活性≥ 2 x 10 7units/mg。