Knock-in

對(duì)于Knock-in，目前還存在一定的難度，大多數(shù)的出版物只能實(shí)現(xiàn)10-40%的敲入效率，不同位點(diǎn)也存在差異。Nature Biotechnology今年5月的一篇出版物利用獨(dú)有的SLEEK (SeLection by Essential-gene Exon Knock-in)技術(shù)可以在T細(xì)胞上實(shí)現(xiàn)超過(guò)90%的KI效率，同樣在其他常用的免疫細(xì)胞如NK，B cell，IPSC等細(xì)胞都實(shí)現(xiàn)了非常高的KI效率。

對(duì)于常規(guī)的KI實(shí)驗(yàn)，我們依然可以從以下方面考量進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化：

 

Donor DNA用量的測(cè)試

▲ Theodore L Roth et al., 2018
 

▲ Zelda Odé et al., 2020

 

HA長(zhǎng)度

HA的長(zhǎng)度會(huì)影響KI的效率，但并不意味著越長(zhǎng)越好。

▲ Zelda Odé et al., 2020
 

▲ Soyoung A. Oh et al., 2022

 

HA修飾

▲ Brian R. Shy et al., 2021
 

▲ Jonas Kath et al., 2022

 

特殊成分提高HDR效率的測(cè)試

也有文獻(xiàn)結(jié)果表明PGA對(duì)KI的效率沒(méi)有幫助，僅供參考。

▲ Ya-Wen Fu et al., 2021
 

▲ David N. Nguyen et al., 2020

 

選擇dsDNA或ssDNA或AAV載體進(jìn)行KI

dsDNA會(huì)隨著用量的增加顯著增加對(duì)細(xì)胞活率的影響。

▲ Theodore L Roth et al., 2018

 

HDR Enhancer

▲ Jonas Kath et al., 2022

 

甚至HDR, RNP, 細(xì)胞的混勻順序也可能會(huì)對(duì)結(jié)果造成影響

▲ Theodore L Roth et al., 2018

 

電轉(zhuǎn)前后培養(yǎng)體系

▲ Theodore L Roth et al., 2018

 

Nucleofection 條件優(yōu)化

通常可以參考KO的條件進(jìn)行KI實(shí)驗(yàn)，但依然可以依照具體的實(shí)驗(yàn)需求調(diào)整。

▲ Theodore L Roth et al., 2018

▲ Soyoung A. Oh et al., 2022

 

對(duì)于Knock-in，還可以通過(guò)其他手段提升結(jié)果，如PAM and Track mutations, 具體內(nèi)容可以參考如Cas蛋白或sgRNA供應(yīng)商。

 

通常KO不會(huì)對(duì)細(xì)胞的活率產(chǎn)生太大影響，但是對(duì)于KI，需要用到donor DNA，如dsDNA，或者使用更強(qiáng)的電轉(zhuǎn)染條件，這些可能會(huì)導(dǎo)致活率的負(fù)面影響。