細(xì)胞凍存和復(fù)蘇是細(xì)胞培養(yǎng)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，直接影響細(xì)胞存活率和活力，關(guān)系到后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)芊癜凑沼?jì)劃有效地進(jìn)行。要想做好細(xì)胞凍存和復(fù)蘇，首先請(qǐng)牢記下面這四個(gè)字：

慢凍快融！

慢凍快融！

慢凍快融！

凍存細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境中的水會(huì)形成冰晶。如果直接將細(xì)胞凍存到 -196℃ 的液氮中，由于凍結(jié)過程中胞外溶液中的水先結(jié)冰，使胞外溶液不斷濃縮，引起細(xì)胞電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水及蛋白質(zhì)變性等，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞受到機(jī)械性損傷。
在冷凍保存時(shí)，細(xì)胞外環(huán)境中的水會(huì)結(jié)冰。冷卻速度的不同會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞由于滲透脫水而發(fā)生不同程度的收縮。細(xì)胞外環(huán)境的滲透壓隨著水結(jié)成冰晶而不斷升高，冷卻速度越慢，細(xì)胞內(nèi)水分通過滲透作用移出細(xì)胞的時(shí)間就越長(zhǎng)。因此，非常緩慢的冷卻可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞因過度脫水而死亡 (A)。而快速冷卻 (C) 會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)形成冰晶，這會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞在復(fù)溫時(shí)死亡。中間冷卻速度 (B) 則可以平衡滲透脫水和細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰形成的風(fēng)險(xiǎn)，通�？梢詫�(shí)現(xiàn)細(xì)胞存活率最大化。

如果在凍存液中加入保護(hù)劑 (如 DMSO)，可使冰點(diǎn)降低，增加細(xì)胞滲透壓穩(wěn)定性。減緩慢速降溫過程中的脫水皺縮現(xiàn)象，在緩慢凍結(jié)時(shí)減少冰晶的生成，使細(xì)胞免受損傷[1]。

 

圖 1. 不同冷卻速度對(duì)細(xì)胞存活率的影響。

 

而在復(fù)蘇時(shí)，需要快速升溫，在 1-2 min 內(nèi)融化并稀釋，這時(shí)細(xì)胞內(nèi)外還來不及形成較大的冰晶，也不會(huì)使細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間暴露在高濃度的電解質(zhì)溶液中，從而避免細(xì)胞損傷，提高細(xì)胞存活率。往期小 M 還為大家介紹了細(xì)胞凍存和復(fù)蘇的步驟 (詳見往期推文：產(chǎn)品上新丨MCE 無血清無蛋白細(xì)胞凍存液)。

 

了解了慢凍快融的原理，還有哪些 Tips 可以提高凍存和復(fù)蘇的成功率呢？一起來看看小 M 為大家準(zhǔn)備的避坑指南吧！

 

 

“天吶細(xì)胞都快長(zhǎng)爆了，我得趕緊凍起來！”
“這次的細(xì)胞好像有點(diǎn)少，算了先凍起來吧！”
“哎？?jī)龃嬉汉孟衽渖倭�，算了少放點(diǎn)吧！”
“哎呀！昨天細(xì)胞放在 -20℃ 忘記轉(zhuǎn)移了，現(xiàn)在再放到 -80℃ 應(yīng)該也沒事吧！”
……
停！
這是妥妥的挖坑行為！
那么凍存細(xì)胞的最佳時(shí)機(jī)是什么時(shí)候？什么樣的細(xì)胞濃度合適？要用多少凍存液呢？怎么實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的“慢凍”呢？看小 M 為大家一一揭曉~
  

 

復(fù)蘇后第二天發(fā)現(xiàn)細(xì)胞沒有活？好不容易復(fù)蘇的細(xì)胞竟然污染了？怎么才能讓細(xì)胞滿血復(fù)活呢？繼續(xù)和小 M 一起往下看吧！

■ 細(xì)胞拿取

盡量減少樣品從液氮或 -80℃ 取出到放置在解凍裝置中之間被動(dòng)升溫的時(shí)間，否則會(huì)大大影響細(xì)胞活力。如果儲(chǔ)存裝置和解凍裝置相隔較遠(yuǎn)，可使用裝有干冰 (-80°C) 或液氮 (-196°C) 的隔熱容器臨時(shí)保存和運(yùn)送細(xì)胞。

(注意：從液氮中取細(xì)胞時(shí)要佩戴護(hù)目鏡和手套，謹(jǐn)防凍傷及凍存管爆炸！)

■ 解凍方式

a) 解凍細(xì)胞時(shí)需要快速升溫 (50~100℃/min) 才能最大保存細(xì)胞活力，最優(yōu)的解凍方式是 37℃ 水浴[3]。從液氮或 -80℃ 取出凍存的細(xì)胞后，稍擰松管蓋，防止解凍過程中凍存管炸裂。放入 37℃ 水浴中，持續(xù)搖晃 1-2 分鐘直至解凍。

通常建議在可見冰融化但樣品仍然冰冷（~0℃）時(shí)立即停止解凍，常見的做法是在只剩下一小片冰時(shí)從水浴鍋中取出樣品。升溫至室溫或更高溫度會(huì)增加冷凍保護(hù)劑的細(xì)胞毒性，這會(huì)極大影響細(xì)胞活力[1]。

b) 不建議室溫解凍細(xì)胞，因?yàn)檫@會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

c) 為降低污染風(fēng)險(xiǎn)，水浴解凍時(shí)凍存管管口要高于水面，避免水流入凍存管，水浴鍋中的無菌水也要定期更換。

■ 稀釋

解凍后應(yīng)盡快稀釋，以減少 DMSO 的細(xì)胞毒性。按照培養(yǎng)基：凍存液 ≥10:1 的比例加入培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，然后離心并更換培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，這樣可以減少由滲透壓變化導(dǎo)致的細(xì)胞應(yīng)激。

■ 換液

依據(jù)細(xì)胞狀態(tài)，在細(xì)胞貼壁后或 24 h 后換液，繼續(xù)培養(yǎng)。

 Q：為什么我復(fù)蘇的細(xì)胞完全不貼壁？

A：可能是由于細(xì)胞凍存前生長(zhǎng)狀態(tài)差或者復(fù)蘇過程中動(dòng)作慢，因此一定要挑選生長(zhǎng)狀態(tài)良好、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行凍存，操作過程要遵循“慢凍快融”的原則！

 Q：為什么我復(fù)蘇細(xì)胞的時(shí)候明明已經(jīng)貼壁了，第二天再去看發(fā)現(xiàn)細(xì)胞全死了？

A：可能是細(xì)胞凍存之前消化過度，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，因此消化細(xì)胞時(shí)一定要嚴(yán)格控制消化時(shí)間哦！

 Q：細(xì)胞復(fù)蘇后只有非常少量細(xì)胞貼壁，是不是需要重新復(fù)蘇？

A：先不要著急丟掉！可以補(bǔ)加血清和細(xì)胞因子，或者每隔 2-3 天換新鮮的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，經(jīng)過 2-3 次換液后，大部分細(xì)胞就能看到明顯增殖，此時(shí)再按照正常傳代操作即可。當(dāng)然，如果細(xì)胞庫存充足，或者著急做實(shí)驗(yàn)，可以重新復(fù)蘇一株細(xì)胞~

 Q：凍存液配多了，不想浪費(fèi)，可以留到下次用嗎？

A：配好的凍存液在 4℃ 可以暫存 1 周，在 -20℃ 最多可保存一個(gè)月。不過最好還是現(xiàn)配現(xiàn)用、避免反復(fù)凍融。

本期小 M 為大家介紹了細(xì)胞凍存與復(fù)蘇的相關(guān)注意事項(xiàng)，看完小 M 分享的避坑指南，是不是對(duì)細(xì)胞凍存和復(fù)蘇的原理以及操作要點(diǎn)了然于心了呢？帶著這份指南，一起養(yǎng)出活力滿滿的細(xì)胞吧！
 

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青霉/鏈霉素雙抗溶液 Penicillin-Streptomycin (100×), Sterile 是已過濾除菌，可直接用于細(xì)胞培養(yǎng)的雙抗溶液 特級(jí)胎牛血清 MCE 特級(jí)胎牛血清 (Fetal Bovine Serum) 來源于非疫區(qū)健康牛 (不含 BVDV、PI3、IBR、BTV 等牛源病毒)，由剖腹產(chǎn) 5-8 月齡胎牛的血液制備而成。

DMEM 培養(yǎng)基 DMEM (High Glucose, L-Glutamine, Pyruvate, Phenol Red, no HEPES), DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) 是廣泛使用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，適于培養(yǎng)多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括 Hela、293、Cos-7、PC-12 等細(xì)胞系，以及原代成纖維細(xì)胞、神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等。

無血清/無蛋白細(xì)胞凍存液 MCE 無血清無蛋白細(xì)胞凍存液是一種非程序性即用型細(xì)胞凍存液。該產(chǎn)品既適用于常規(guī)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的凍存，也適用于無血清培養(yǎng)細(xì)胞的凍存。

支原體清除試劑 MCE BM-Cyclin 主要成分為延胡索酸泰妙菌素（Tiamulin fumarate）和鹽酸米諾環(huán)素（Minocycline hydrochloride），可在不影響細(xì)胞狀態(tài)的前提下，有效抑制和清除在細(xì)胞培養(yǎng)中廣泛存在的支原體污染，對(duì)于常見的革蘭氏陰性和陽性菌也有一定的清除作用。

青霉/鏈霉素雙抗溶液 Penicillin-Streptomycin (100×), Sterile 是已過濾除菌，可直接用于細(xì)胞培養(yǎng)的雙抗溶液。

[1] Baust JM, et al. Best practices for cryopreserving, thawing, recovering, and assessing cells. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2017;53(10):855-871. 
 
[2] Loecker W, et al. Effects of cell concentration on viability and metabolic activity during cryopreservation. Cryobiology. 1998;37(2):103-109.
 
[3] Baust,et al. Development and Assessment of a Novel Device for the Controlled, Dry Thawing of Cryopreserved Cell Products. BioProcessing Journal. 2016;15. 30-41.