PROTAC技術(shù)助力針對(duì)“不可成藥”癌癥基因靶點(diǎn)的藥物開發(fā)研究
•所謂“不可成藥（undruggable）”，常用來(lái)描述傳統(tǒng)藥物研發(fā)中那些因結(jié)構(gòu)和功能特征而難以成為用藥靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)。
•最近，美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）加速批準(zhǔn)了一種用于治療NSCLC的KRAS抑制劑，KRAS就是“不可成藥”基因的一個(gè)典型例子。
•PROTAC技術(shù)可以成為開發(fā)針對(duì)“不可成藥”基因的有效療法的有力工具。
二十年前，在人類基因組計(jì)劃第一版發(fā)表后不久，霍普金斯和格魯姆（1）提出了“可成藥性”的概念。他們估計(jì)，在30,000個(gè)預(yù)測(cè)的人類蛋白質(zhì)編碼基因中，只有約15%有可能成為可利用的藥物靶點(diǎn)，這意味著其余85%的蛋白質(zhì)組被認(rèn)為是無(wú)法用藥的�？茖W(xué)的進(jìn)步使這兩類基因之間的區(qū)別越來(lái)越模糊，許多最初被認(rèn)為無(wú)法用藥的基因?qū)嶋H上已經(jīng)成功地成為靶點(diǎn)（如BCL-2家族成員）。
好的治療靶點(diǎn)有哪些特征？
1. 功能/活性。必須從一系列疾病或癥狀的驅(qū)動(dòng)因素中選擇潛在的靶蛋白。歷史上，典型的藥物靶點(diǎn)包括G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）、核受體、離子通道和酶，因?yàn)樗鼈兙哂?ldquo;活性”功能，更容易擊中。隨著時(shí)間的推移，具有不同功能的蛋白質(zhì)，如參與特定蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）的蛋白質(zhì)以及支架蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白越來(lái)越多地被視為潛在靶標(biāo)（2）。一個(gè)隱患是，與疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)通常在健康細(xì)胞和組織中具有非病理性活性。因此，一味抑制它們的功能可能會(huì)導(dǎo)致不必要的副作用。
2. 表達(dá)。與前述觀點(diǎn)一致，理想的候選蛋白質(zhì)不應(yīng)普遍表達(dá)，因?yàn)楫?dāng)“功能障礙”主要定位于特定組織時(shí)，發(fā)生脫靶效應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)較低�？紤]到藥物開發(fā)的主要瓶頸之一是脫靶效應(yīng)，脫靶效應(yīng)會(huì)導(dǎo)致與劑量相關(guān)的毒性和/或劑量有限的療效，因此這一點(diǎn)尤為重要。為了克服這一困難，大量研究人員致力于開發(fā)專門針對(duì)相關(guān)細(xì)胞的給藥策略（如基于抗體、肽、適配體的給藥策略）（3）。
3. 可及性。組織和細(xì)胞蛋白質(zhì)的表達(dá)部位也與治療藥物能否輕易到達(dá)有關(guān)。例如，血腦屏障使大腦相對(duì)難以進(jìn)入。因此，任何試圖攻擊神經(jīng)元蛋白質(zhì)的嘗試都需要考慮這一障礙。此外，蛋白質(zhì)對(duì)特定藥物的可及性還取決于其在細(xì)胞水平的位置（如細(xì)胞表面、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核/其他細(xì)胞器、細(xì)胞外環(huán)境）。例如，治療性抗體可以到達(dá)蛋白質(zhì)的細(xì)胞外部分，而細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)則需要能夠穿透細(xì)胞的小分子化合物。
4. 結(jié)構(gòu)。從歷史上看，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)具有疏水結(jié)合袋和/或--在酶的情況下--明確的活性位點(diǎn)，可以容納候選藥物時(shí)，蛋白質(zhì)就被認(rèn)為是可藥用的。相反，信號(hào)分子、結(jié)構(gòu)蛋白等的活性通常依賴于蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用，因此依賴于其三級(jí)或四級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。這種內(nèi)在的可變性和缺乏確定的溝槽使得識(shí)別潛在藥物的結(jié)構(gòu)和物理特征（如大小、極性等）變得更加困難。
5. 結(jié)合親和力。與酶抑制特別相關(guān)，它表示酶識(shí)別特定底物的能力：親和力越高，結(jié)合能力越強(qiáng)，即使底物濃度很低。對(duì)底物具有高親和力的酶是更棘手的藥物靶點(diǎn)，因?yàn)闈撛谝种苿┬枰獦O高濃度（有時(shí)甚至是不可行的濃度）才能與底物競(jìng)爭(zhēng)。
不可成藥的癌癥基因
癌癥是導(dǎo)致全球死亡的主要原因之一（4），因此開發(fā)有效的治療方法是藥物發(fā)現(xiàn)活動(dòng)的主要目標(biāo)之一。癌癥類型和病因的多樣性使得這項(xiàng)工作尤為復(fù)雜。在已發(fā)現(xiàn)的700個(gè)癌癥基因中，目前僅有約40個(gè)基因的治療方法獲得批準(zhǔn)（5）。此外，大多數(shù)研究工作往往集中在一組有限的“易藥”蛋白上（如HER2、EFGR、ALK、PD-1/PD-L1、雌激素受體或雄激素受體），因此，對(duì)于同一靶點(diǎn)，無(wú)論其在癌癥發(fā)生或發(fā)展中的實(shí)際發(fā)生率如何，都有多種FDA批準(zhǔn)的藥物可用。例如，雖然“僅”在3%-5%的非小細(xì)胞肺癌中發(fā)現(xiàn)的ALK基因重排有五種已獲批準(zhǔn)的治療方法（5,6），但絕大多數(shù)最常見的癌基因改變直到最近仍被認(rèn)為是“不可成藥”的。
RAS、MYC和TP53就是典型的例子。事實(shí)上，RAS是癌癥中最常見的突變癌基因，MYC是最常見的擴(kuò)增癌基因，而TP53則是最常見的突變和/或刪除腫瘤抑制基因（5）。這些基因突變是如此常見，以至于在任何人類癌癥中都有可能發(fā)現(xiàn)其中至少一種基因突變。不過(guò)，上一段中提到的幾個(gè)特征也適用于這些蛋白質(zhì)。例如：
•它們表達(dá)廣泛，對(duì)細(xì)胞的正常功能起著關(guān)鍵作用，因此脫靶風(fēng)險(xiǎn)很高。
•它們位于細(xì)胞內(nèi)部（尤其是P53和c-Myc），因此更難到達(dá)。
•它們沒有一個(gè)明確的口袋，潛在的低分子量藥物無(wú)法與之結(jié)合。
•c-Myc是一種內(nèi)在無(wú)序蛋白（IDP），具有擴(kuò)展的非結(jié)構(gòu)化表面，因此缺乏常規(guī)藥物的靶“熱點(diǎn)”。
•P53和MYC沒有酶活性，因此不能使用催化抑制劑。
•RAS具有內(nèi)在的GTP酶活性，但其對(duì)GTP的高親和力和細(xì)胞內(nèi)GTP濃度的升高使得開發(fā)競(jìng)爭(zhēng)性抑制藥物的可能性很小。
然而，盡管這些基因被稱為“不可成藥的基因”，但最近的研究進(jìn)展使得潛在的治療策略得以開發(fā)，并在最近取得了突破性進(jìn)展：2021年5月，美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）加速批準(zhǔn)RAS GTPase家族抑制劑索托拉西布（Sotorasib）用于治療KRAS G12C突變的轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）成人患者（7）。
靶向KRAS的成功案例
1. Ras家族Ras。蛋白家族由三個(gè)同源基因編碼，即HRAS、KRAS和NRAS，代表了一些最早被描述的致癌基因。它們最初在60年代被發(fā)現(xiàn)是誘發(fā)大鼠肉瘤的病毒成分（因此被稱為RAS：大鼠肉瘤病毒），它們的發(fā)現(xiàn)改變了我們對(duì)癌癥生物學(xué)的認(rèn)識(shí)（7、8、9）。Ras蛋白屬于G蛋白（鳥苷酸核苷酸結(jié)合蛋白）類。它們以GTP結(jié)合的活性形式和GDP結(jié)合的非活性形式交替發(fā)揮作用，就像多個(gè)信號(hào)通路的開關(guān)一樣（7）。所有三種形式的Ras都是膜相關(guān)蛋白，附著在細(xì)胞膜上對(duì)它們的功能至關(guān)重要。在靜止細(xì)胞中，Ras蛋白與GDP結(jié)合。受體酪氨酸激酶（RTKs）或GPCRs等各種膜受體可激活Ras信號(hào)傳導(dǎo)，這些受體與配體相互作用后，會(huì)將鳥嘌呤核苷酸交換因子（GEFs）招募到膜上，進(jìn)而誘導(dǎo)GDP與Ras分離。在短暫的無(wú)核苷酸狀態(tài)之后，Ras與GTP結(jié)合，進(jìn)入其活性狀態(tài)，在這種狀態(tài)下，它可以與各種效應(yīng)蛋白相互作用，誘導(dǎo)不同的細(xì)胞反應(yīng)。圖1描述了Ras下游的主要通路，如參與細(xì)胞周期進(jìn)展的RAF/MAPK/ERK 通路；參與細(xì)胞存活和代謝調(diào)節(jié)的PI3K/AKT信號(hào)通路；參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和遷移的 PLCε/PIP2 級(jí)聯(lián)通路。在正常細(xì)胞中，Ras會(huì)被稱為GTP激活蛋白（GAP）的調(diào)節(jié)蛋白關(guān)閉，GAP會(huì)加速GTP的水解，使Ras轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)活性的GDP結(jié)合態(tài)。
圖1 Ras信號(hào)通路
RAS基因發(fā)生致癌突變后，最常見的后果之一就是對(duì)GAP產(chǎn)生抗性，從而持續(xù)處于活性狀態(tài)。約30%的人類癌癥中都存在RAS基因突變，其中KRAS基因突變最常見（約占80%），其次是NRAS（12%）和HRAS（3%）（5）。KRAS密碼子12和13都編碼甘氨酸殘基，是最常見的致癌激活位點(diǎn)，90%以上的記錄突變都發(fā)生在這些位點(diǎn)上。這些殘基與GDP/GTP結(jié)合袋相鄰。甘氨酸與其他氨基酸的替換會(huì)干擾GTP酶的活性，甚至在GAPs結(jié)合后也會(huì)將KRas鎖定在 GTP結(jié)合的活性狀態(tài)（11）。
2. 針對(duì)Ras的治療。鑒于RAS基因突變?cè)谌祟惏┌Y中的發(fā)生率很高，多年來(lái)，人們一直在努力開發(fā)能夠?qū)筊AS基因突變的藥物。下面僅列舉幾個(gè)例子。有人嘗試抑制負(fù)責(zé)前炔化的酶，前炔化是Ras與細(xì)胞膜內(nèi)層結(jié)合所需的翻譯后修飾。目前有幾種藥物正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)，其中一種名為Tipifarnib的藥物獲得了美國(guó)食品及藥物管理局（FDA）的“快速通道”認(rèn)證，用于治療HRAS突變的頭頸部鱗狀細(xì)胞癌和T細(xì)胞淋巴瘤患者（5）。
另一種流行的策略是嘗試抑制下游信號(hào)傳導(dǎo)，即通過(guò)抑制通路的效應(yīng)因子（如RAF/MEK/ERK或PI3K/Akt），或直接阻止Ras與這些效應(yīng)因子的相互作用。到目前為止，第一種策略并沒有取得令人鼓舞的結(jié)果，這可能是由于細(xì)胞采用了代償機(jī)制。相反，Rigosertib作為一種Ras擬態(tài)化合物，似乎能夠阻斷Ras效應(yīng)器的下游信號(hào)傳導(dǎo)，從而抑制臨床前模型中的腫瘤生長(zhǎng)（5、12）。該分子目前正在進(jìn)行多項(xiàng)臨床試驗(yàn)。
最后，有關(guān)Ras突變體的結(jié)構(gòu)信息使我們能夠直接靶向Ras突變體。特別是 KRAS G12C（其中一個(gè)半胱氨酸殘基取代了由密碼子12編碼的甘氨酸）顯示了一個(gè)調(diào)節(jié)袋，人們利用這個(gè)調(diào)節(jié)袋開發(fā)出了對(duì)野生型RAS沒有檢測(cè)到影響的特異性抑制劑。其中，前面提到的Sotorasib（原名AMG510）是第一個(gè)獲得 FDA 批準(zhǔn)的KRAS阻斷藥物。它能選擇性地、不可逆地抑制突變蛋白，并將其鎖定為無(wú)活性的GDP結(jié)合形式，從而使KRAS G12C腫瘤消退，并提高化療的抗腫瘤療效（13）。在臨床試驗(yàn)“CodeBreak100”中，Sotorasib使36%的參與者的腫瘤縮�。ㄏ啾戎拢瑯�(biāo)準(zhǔn)療法的腫瘤縮小率為20%）。這些腫瘤反應(yīng)的中位持續(xù)時(shí)間為10個(gè)月（而標(biāo)準(zhǔn)療法的預(yù)期壽命較短）（14）。與其他任何藥物治療一樣，Sotorasib也會(huì)產(chǎn)生一些副作用，大多數(shù)情況下副作用較輕（如腹瀉、惡心、肌肉和骨骼疼痛），但有20%的參與者副作用較重。由于Sotorasib這么快就獲得了美國(guó)食品藥品管理局的加速批準(zhǔn)，目前仍在進(jìn)行更多的試驗(yàn)，以確認(rèn)該療法是否能幫助NSCLC患者延長(zhǎng)壽命，而不會(huì)導(dǎo)致癌癥惡化（14）。希望這一成功故事不僅能在其他已在臨床試驗(yàn)中的類似抑制劑中復(fù)制，而且還能促進(jìn)針對(duì)不同KRAS突變的化合物的開發(fā)。
PROteolysis-TArgeting Chimaera（PROTAC）技術(shù)：挑戰(zhàn)“不可成藥”靶點(diǎn)
如上所述，盡管取得了令人鼓舞的重要科學(xué)進(jìn)步，但藥物發(fā)現(xiàn)仍然在很大程度上依賴于使用能夠占據(jù)目標(biāo)蛋白質(zhì)上特定活性位點(diǎn)、直接影響其功能的分子。因此，在缺乏這些確定區(qū)域的情況下，很難制定出適當(dāng)?shù)牟呗浴?/span>
在這種情況下，最近開發(fā)出了多種雜多功能分子，它們將一種能結(jié)合感興趣的蛋白質(zhì)（POI）的配體與另一種能與E3泛素連接酶結(jié)合的配體綁在一起，促進(jìn)前者的泛素化，然后由26S蛋白質(zhì)體降解，這可能會(huì)對(duì)“給“無(wú)法藥用”的基因下藥”產(chǎn)生重大影響。這些異功能分子被稱為PROteolysis-TArgeting Chimeras或PROTACs15（圖 2）。
圖2 PROTACs機(jī)制
PROTACs不需要基因修飾（不同于其他技術(shù)，如RNAi或基因KO）；不需要 POI上存在活性位點(diǎn)；使用濃度比傳統(tǒng)小分子低，因?yàn)榕c靶點(diǎn)的瞬時(shí)相互作用就足以將其導(dǎo)向蛋白酶體；它們還適用于通過(guò)過(guò)表達(dá)克服抑制劑作用的靶點(diǎn)，如癌癥中經(jīng)常出現(xiàn)的靶點(diǎn)（15、16）。例如，BRD4是一種轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳調(diào)控因子，通過(guò)激活多個(gè)癌基因（如c-Myc）的轉(zhuǎn)錄，在癌癥發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。BRD4抑制劑會(huì)因BRD4表達(dá)增加而迅速失去藥效，而BRD4-PROTACs則不受這種機(jī)制的影響（16、17）。
Enzo life的PROTACs以表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）和BET溴域蛋白（如A1874）為靶標(biāo)。這是一種基于堅(jiān)果素的PROTAC，靶向BRD4，因此由BRD4配體（JQ1）與MDM2 E3配體（RG7388）連接組成。正如Hines J等人最近證明的那樣（15），A1874具有雙重功能，它能誘導(dǎo)其靶標(biāo)降解，并伴隨著c-Myc的下調(diào)、P53的穩(wěn)定和P21的上調(diào)。
藥物發(fā)現(xiàn)的研究工具：
• SCREEN-WELL® Cancer Library和SCREEN-WELL® Kinase Inhibitor library等化合物庫(kù)可以成為癌癥抑制劑篩選和藥物開發(fā)的強(qiáng)大工具。
• AKT、PKA和PKC檢測(cè)試劑盒可以通過(guò)分析樣品中的致癌信號(hào)變異來(lái)補(bǔ)充篩選工作。
• CELLESTIAL®目錄中的熒光探針可對(duì)細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)（如細(xì)胞凋亡/壞死、細(xì)胞毒性、氧化應(yīng)激、細(xì)胞器功能動(dòng)態(tài)等）進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析。
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