數字PCR（dPCR）是一種核酸絕對定量的技術，與傳統(tǒng)的熒光定量PCR技術（qPCR）相比，dPCR擁有可以精確到單個核酸分子的高精準度、適合復雜樣本的高便捷度、且無需標準曲線或參照基因進行對比分析等特點。因此，高靈敏度、絕對定量、高穩(wěn)定性和更高的抗干擾能力成為數字PCR的4大優(yōu)勢。
 

作為最常見的腫瘤之一，胃癌(GC)具有高死亡率，因為當前的檢查方法不能實現早期診斷。核粒梭菌(Fn)主要定居在口腔中，據報道與胃腸道腫瘤的發(fā)展有關。迄今為止，關于唾液Fn和胃癌之間的關系知之甚少。該篇來自山東大學齊魯醫(yī)院文章確定唾液Fn能否作為診斷胃癌的生物標志物，并探討Fn對胃癌細胞的影響。

實驗方法：通過液滴數字聚合酶鏈反應對2019年1月至2020年12月山東大學齊魯醫(yī)院的120例GC患者、31例萎縮性胃炎(AG)患者、35例非AG (NAG)患者、26例胃息肉(GP)患者和20例正常對照(NC)的唾液中Fn的豐度進行定量。進行受試者工作特征(ROC)曲線分析，以評估Fn以及傳統(tǒng)血清腫瘤標志物(包括癌胚抗原(CEA)、糖類抗原(CA) 19-9和CA72-4)的診斷價值。Transwell實驗和傷口愈合實驗評估Fn感染對GC細胞的影響。western blot法檢測上皮間質轉化(EMT)標記物的表達。

★實驗流程：

• 研究人員的樣本收集，120例GC患者、31例萎縮性胃炎(AG)患者、35例非AG (NAG)患者、26例胃息肉(GP)患者和20例正常對照(NC)的唾液樣本的收集，離心后儲存在-80℃。
• 使用凱杰QIAamp Blood Mini Kit試劑盒提取200ul唾液樣本中的基因組DNA，濃度用Qubit 3熒光計測定。
• 使用上海小海龜數字PCR儀進行Fn的測定，設計Fn的探針進行檢測。
• GC細胞的培養(yǎng)，Fn的菌株培養(yǎng)
• 將GC細胞和Fn的菌株共培養(yǎng)，進行感染
• 將感染后的GC細胞進行Transwell分析
• 傷口愈合實驗，感染后的GC細胞進行Transwell分析，感染后用200 μL的移液管尖端進行直線刮擦，模擬傷口，隨后，除去培養(yǎng)基和漂浮細胞，用無血清培養(yǎng)基代替，并捕獲圖像。細胞培養(yǎng)48小時后，再次拍攝圖像。
• Western blot分析，將感染Fn和未感染Fn的GC細胞裂解進行Western blot分析

實驗結果：核粒梭菌(Fn)是一種牙周致病菌，常見于胃腸道腫瘤組織中。在此，研究發(fā)現胃癌患者唾液Fn水平升高，可作為胃癌診斷的潛在生物標志物，其診斷能力優(yōu)于傳統(tǒng)的血清腫瘤標志物。研究還發(fā)現唾液Fn水平與胃癌TNM分期和淋巴結轉移呈正相關。此外，實驗在試管內揭示了Fn通過促進上皮-間質轉化過程來促進GC細胞的遷移和侵襲。該發(fā)現表明唾液Fn是診斷胃癌的潛在生物標志物。該研究表明唾液中Fn含量可作為診斷胃癌的生物標志物，Fn感染可通過加速上皮間質轉化過程促進胃癌轉移。