叔醇單元是許多藥物和農(nóng)用化學(xué)品中重要的部分。目前獲得叔醇單元的方法主要是酮的親核加成與烯烴的羰基羥基化反應(yīng)，這兩種反應(yīng)在立體選擇性上均存在一定的缺陷。因此，發(fā)展出一種不對(duì)稱催化手段獲得叔醇是一個(gè)值得探索的課題。

康奈爾大學(xué)的Todd K. Hyster團(tuán)隊(duì)在此前的研究中，發(fā)現(xiàn)黃素依賴的烯還原酶（“ene”-reductases，EREDs）可以通過自由基機(jī)理催化C-C鍵的形成。隨后的多項(xiàng)研究中，EREDs完成了各種不對(duì)稱還原加氫烷基化和加氫磺酰化反應(yīng)，是一種很有潛力的酶。作者認(rèn)為，EREDs既然可以催化烯烴的加氫烷基化，那么只要將自由基淬滅的步驟，從還原型變?yōu)檠趸�型，就可以催化烯烴的不對(duì)稱羰基羥基化，從而制備叔醇類化合物。近日，該團(tuán)隊(duì)在JACS上發(fā)表《Asymmetric Carbohydroxylation of Alkenes Using Photoenzymatic Catalysis》的一文，就講述了這樣的故事。
 

過程

首先，作者對(duì)一系列EREDs進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)來源于Pseudomonas putida的嗎啡酮還原酶MorB在綠光照射下，可以催化烯烴的羰基羥基化，轉(zhuǎn)化率為45%，對(duì)映體比為75:25，副反應(yīng)產(chǎn)物只占10%。作者遂以MorB為起點(diǎn)，旨在提高轉(zhuǎn)化率和立體專一性。作者選取了催化位點(diǎn)附近的21個(gè)氨基酸進(jìn)行了飽和突變。第一輪飽和突變的最佳效果為轉(zhuǎn)化率提高至83%，對(duì)映體比為87:13。第二輪突變中，作者對(duì)第一輪中有良好表現(xiàn)的位點(diǎn)進(jìn)行了細(xì)致研究，Y72C突變更換為T使得兩個(gè)指標(biāo)分別提高至94%和92:8。隨后作者又進(jìn)行了兩輪突變、組合和篩選，最終獲得最佳突變體為MorB-Y72T-C191G-T240E-R110L-V73D-S34Q（命名為MorB-B3），轉(zhuǎn)化率為95%，對(duì)映體比為95:5。
 

隨后，作者研究了MorB-B3的底物譜。對(duì)于α-溴代芳香酮，該酶可以催化對(duì)位和間位有取代基的底物，供電子取代基的轉(zhuǎn)化率比吸電子取代基的高；鄰位取代方面，如果取代基較小，MorB-B3仍然可以催化；對(duì)于更大的芳香基團(tuán)，如萘、苯并呋喃，MorB-B3也可催化反應(yīng)發(fā)生。

對(duì)于烯烴方面，大的吸電子取代基會(huì)對(duì)反應(yīng)產(chǎn)生負(fù)面影響，而三取代烯烴、非苯乙烯均可發(fā)生反應(yīng)。 
 

接著，作者做了一系列實(shí)驗(yàn)以探究反應(yīng)機(jī)理。依據(jù)該類酶的特征，自由基的引發(fā)階段應(yīng)當(dāng)是由酶模板的電荷轉(zhuǎn)移復(fù)合物（enzyme-templated charge transfer complex）作用。但是作者發(fā)現(xiàn)，紫外-可見光并不能檢測(cè)到該復(fù)合物，這是由于即使在非光照條件下，底物的結(jié)合也可使黃素自由基氧化。那么自由基是如何淬滅的呢？作者提出了兩種猜想：一是過渡態(tài)1被氧化為陽離子的過渡態(tài)2，這個(gè)過程不成環(huán)；二是過渡態(tài)1發(fā)生環(huán)化形成過渡態(tài)3，形成氧自由基，隨后水解。為了探究究竟是哪個(gè)機(jī)理，作者設(shè)計(jì)了苯環(huán)上又羥甲基取代的底物36，如果反應(yīng)遵從第一種機(jī)理，那么會(huì)形成五元氧環(huán)的副產(chǎn)物。然而實(shí)際檢測(cè)中，該副產(chǎn)物的含量極低，故該反應(yīng)并非按第一種機(jī)理發(fā)生。作者又設(shè)計(jì)了鄰位取代為羧酸或甲酯基團(tuán)的底物38和39，若反應(yīng)遵從第二種機(jī)理，那么羧酸或甲酯的羰基會(huì)與氧自由基反應(yīng)形成內(nèi)酯。實(shí)際檢測(cè)中確實(shí)檢測(cè)到了內(nèi)酯的生成，故應(yīng)當(dāng)為第二種機(jī)理。

作者又進(jìn)行了過渡態(tài)計(jì)算，計(jì)算結(jié)果表明過渡態(tài)1氧化形成過渡態(tài)2，比過渡態(tài)3形成過渡態(tài)4需要克服的能量高很多。該結(jié)果也支持第二種機(jī)理。

總結(jié)與展望

本文開發(fā)了一種通過光酶催化烯烴羰基羥基化反應(yīng)不對(duì)稱合成叔醇的方法。這篇文章的idea需要很強(qiáng)的化學(xué)功底和想象力，作者從反應(yīng)機(jī)理出發(fā)，把兩個(gè)看上去相去甚遠(yuǎn)的反應(yīng)（加氫烷基化和羰基羥基化）聯(lián)系到了一起，即“透過現(xiàn)象看本質(zhì)”，在EREDs的作用中，自由基引發(fā)和C-C鍵的形成均是相同的，區(qū)別就在于最終的自由基淬滅。作者大膽的猜想了EREDs對(duì)于這種反應(yīng)的潛力，做了一系列實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，并且巧妙地設(shè)計(jì)了底物討論了反應(yīng)機(jī)理。這項(xiàng)工作對(duì)開發(fā)酶的潛力，解鎖“舊”酶的新反應(yīng)提供了很好的啟示。

參考文獻(xiàn)

1. Ouyang, Y.; Turek-Herman, J.; Qiao, T. Z.; Hyster, T. K., Asymmetric Carbohydroxylation of Alkenes Using Photoenzymatic Catalysis. J Am Chem Soc 2023, 145 (31), 17018-17022.

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編譯：江淮之間

編輯：Liu