納米孔測序儀在線粒體DNA控制區(qū)異質性檢測分析全流程中的應用
近日，四川大學華西基礎醫(yī)學與法醫(yī)學學院的侯一平教授團隊基于國產(chǎn)QNome納米孔測序平臺，在法醫(yī)遺傳學的TOP期刊Forensic Science International: Genetics上在線發(fā)表題為《CmVCall: an automated and adjustable nanopore analysis pipeline for heteroplasmy detection of the control region in human mitochondrial genome》的研究成果。
研究團隊基于齊碳科技納米孔QNome測序平臺自主開發(fā)了mtDNA控制區(qū)異質性檢測分析全流程—CmVCall，研究結果表明齊碳QNome平臺對線粒體控制區(qū)序列識別具有簡便性和適用性。
此研究為納米孔基因測序技術常規(guī)應用于線粒體基因組奠定了堅實的基礎，也進一步拓展了齊碳科技納米孔測序平臺的應用場景。
背景
線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）是真核生物中獨立于核基因組之外的遺傳物質，呈閉環(huán)雙鏈結構，具有母系遺傳、多拷貝、異質性閾值效應及變異率較高等特點。由于mtDNA 特殊的遺傳特征和環(huán)狀分子結構，mtDNA檢測分析在法醫(yī)學、群體遺傳學、人類生態(tài)學、分子進化和考古學有重要的應用意義。
mtDNA序列及異質性分析在很大程度上依賴于測序技術。Sanger測序由于流程相對繁瑣、分辨率較低、通量不足；在mtDNA異質性應用中往往受限。下一代測序技術（NGS）本質為短讀長測序，分析mtDNA需要拼接多個短片段擴增子，擴增效率對異質性比例的識別存在潛在影響。此外，短片段擴增的非特異性容易受到核線粒體DNA（nuclear mitochondrial DNA，NUMT）序列的影響，從而使mtDNA分析變得復雜。
作為最新一代基因測序技術，納米孔測序可利用其讀長長、實時測序的天然優(yōu)勢改善或避免以上限制，為異質性檢測提供全新的方法和見解。目前，納米孔測序技術的應用已在多個臨床和生物學領域得到了開發(fā)，然而，利用該技術進行mtDNA異質性檢測的研究報道卻還很少。
作為國內首家自主研發(fā)納米孔基因測序技術的齊碳科技，QNome平臺已被應用于各種生物學研究，平臺在微單倍型遺傳標記的分型研究結果已發(fā)表于Forensic Science International: Genetics (2022, 57, 102657)，其法醫(yī)適用性也得到了初步證實。（點擊此處即可跳轉閱讀原文）
此次，侯一平教授團隊基于齊碳QNome平臺，進一步開展納米孔基因測序技術在線粒體基因組研究的應用探索，以期改善傳統(tǒng)測序技術帶來的局限性，獲得更高準確性的檢測結果。
成果概述
研究團隊首先評估了四種常用的variant callers在人類mtDNA控制區(qū)異質性認證中的性能，基于模擬混合兩個合成序列( rCRS 和SSHS)樣本的QNome納米孔測序reads產(chǎn)生的不同比例（50:50, 75:25, 80:20, 85:15, 90:10, 95:5）的混合樣本。
隨后，基于QNome測序平臺自主開發(fā)了mtDNA控制區(qū)異質性檢測分析框架—CmVCall，該工具整合了多個數(shù)據(jù)處理程序，可執(zhí)行讀取過濾、去除核線粒體序列（numt）、比對、可選擇的“校正”模式和最終的異質性識別，并驗證了其在低異質性水平上的表現(xiàn)。
Fig1 CmVCall pipeline.
同卵雙胞胎（MZ）由于特殊的胚胎發(fā)生機制，具有極其相似的遺傳特征。從早期的遺傳“共識（一致性）”角度來看，他們的遺傳信息甚至是完全一樣的，無法通過常規(guī)的法庭科學DNA檢測手段來區(qū)分，也對法醫(yī)調查提出了挑戰(zhàn)。在本研究中，為了探究納米孔測序技術在雙胞胎線粒體異質性識別中的潛力，研究團隊還使用來自同卵雙胞胎（MZ）的血液、唾液和毛發(fā)樣本進行異質性檢測評估，并與NGS平臺數(shù)據(jù)進行比較。
成果亮點
1.納米孔測序結果表明CmVCall具有很高的準確性，可用于納米孔測序數(shù)據(jù)mtDNA控制區(qū)的異質性檢測。使用“無校正”選項，pipeline可以檢測到低至10%的異質性水平，而使用“校正”選項，可以準確識別5%的低頻異質性位點，精度、準確性和召回率分別為100%、99.9%和92.3%。 
2. 人類線粒體基因組中多聚物（homopolymer）區(qū)域的分析一直是生物信息分析學研究中的一個挑戰(zhàn)。以往的研究在檢測異質性時，通常會丟棄這些區(qū)域。為了減少這些區(qū)域的錯誤率，測序生化體系和分析工具均在不斷改進中。本研究中，通過納米孔測序結合pipeline工具的嚴格過濾，避免了數(shù)據(jù)分析過程中不必要的“丟棄”，從而獲得更高水平的個體間和個體內多態(tài)位點。
將QNome平臺和Ion Torrent 平臺產(chǎn)生的測序數(shù)據(jù)進行對比，結果顯示，兩個平臺的異質性調用呈現(xiàn)一定程度的一致性。納米孔測序基于“校正”模式可以比NGS平臺識別出更多的異質性，并在具有高覆蓋率的多聚物區(qū)域也識別出異質性位點，顯示出納米孔測序技術的應用潛力。
3.研究團隊統(tǒng)計了每對雙胞胎三種類型樣本之間的mtDNA控制區(qū)微小差異。結果表明基于NGS數(shù)據(jù)，四對MZ雙胞胎的兩個體可以通過毛發(fā)樣本的異質性位點被區(qū)分開來，而基于QNome校正數(shù)據(jù)，雙胞胎樣本的三種樣本類型的mtDNA控制區(qū)檢測出更多的異質性，可以區(qū)分全部7對雙胞胎樣本中的兩個體。
結語
綜上所述，CmVCall具有很高的準確性，并且適合用于利用納米孔測序數(shù)據(jù)進行mtDNA控制區(qū)的異質性檢測。在“校正”選項下，5%水平異質性的精度、準確性和召回率分別為100%、99.9%和92.3%。在使用MZ樣本的驗證和比較中，結果表明，CmVCall可以比NGS能夠識別到更多的異質性位點，揭示了個體間和個體內mtDNA細微差別。同時，該研究還鑒定了一些具有極高覆蓋率和可信度的homopolymer異質性位點，這意味著利用納米孔測序和CmVCall檢測這些區(qū)域的異質性具有潛力。
研究團隊表示，針對homopolymer區(qū)域的額外驗證方法和新工具的不斷開發(fā)仍然是非常必要的。此次研究的調查樣本量仍然較小，預計將基于齊碳納米孔測序技術繼續(xù)使用CmVCall分析更多類型的數(shù)據(jù)集和更大的樣本量以進一步進行估計和改進，相信這一工具將為未來開發(fā)針對線粒體全基因組的納米孔測序pipeline奠定堅實基礎。
作為國內第一家全面掌握納米孔測序技術并將之推向商業(yè)化的企業(yè)，齊碳持續(xù)技術研發(fā)、擴充產(chǎn)品矩陣，不斷解鎖更多應用場景，讓這項高精尖的技術產(chǎn)生更多的現(xiàn)實生產(chǎn)力。
目前，已經(jīng)形成了以基因測序儀為核心，配套有試劑、芯片及軟件的測序平臺。此外還有實驗室自動化、生信分析等應用支撐產(chǎn)品，形成了完整的基因測序全鏈條解決方案。
今年3月，齊碳重磅發(fā)布了全新迭代升級的K2體系，帶來了更準、更穩(wěn)、更高效的測序體驗。單次準確率從90%躍升至97%，Consensus 準確率（70x）從Q40提升至Q50，不僅 Homopolymer 分辨能力大幅提升，還實現(xiàn)了高精度短序列測序，同時上樣量也大幅減少。
8月18日，齊碳時隔一年再發(fā)新品，重磅推出自主研發(fā)的中通量納米孔基因測序平臺QPursue，從低通量QNome測序平臺擴展到中通量測序平臺QPursue，不僅展現(xiàn)了齊碳強勁的研發(fā)實力和創(chuàng)新能力，也代表著國內納米孔基因測序技術的最前沿水平。
未來，齊碳科技將持續(xù)深耕，不斷提升測序性能、降低測序成本，充分挖掘納米孔測序技術的優(yōu)勢潛能，推動納米孔測序技術迭代和產(chǎn)業(yè)化應用，加速納米孔基因測序儀國產(chǎn)化時代進程！
特別鳴謝四川大學華西基礎醫(yī)學與法醫(yī)學學院的侯一平教授團隊對本文的指導！
參考文獻：
[1]Lirong Jiang, Jing Liu,Suyu Li,et,al. CmVCall: an automated and adjustable nanopore analysis pipeline for heteroplasmy detection of the control region in human mitochondrial genome.Forensic Science International: Genetics.Volume 67, November 2023, 102930.
2021年12月，齊碳科技通過5年的自主研發(fā)，成功推出國內首臺商業(yè)化的納米孔基因測序儀QNome-3841，并宣布首個生產(chǎn)基地竣工，正式開啟納米孔基因測序國產(chǎn)化時代。2022年6月，齊碳科技發(fā)布納米孔基因測序儀QNome-3841hex，標志著國產(chǎn)納米孔基因測序儀開始了矩陣化發(fā)展，這也為靈活測序場景提供全新的解決方案，將更好地滿足市場應用的多元需求。
研究團隊基于齊碳科技納米孔QNome測序平臺自主開發(fā)了mtDNA控制區(qū)異質性檢測分析全流程—CmVCall，研究結果表明齊碳QNome平臺對線粒體控制區(qū)序列識別具有簡便性和適用性。
此研究為納米孔基因測序技術常規(guī)應用于線粒體基因組奠定了堅實的基礎，也進一步拓展了齊碳科技納米孔測序平臺的應用場景。
背景
線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）是真核生物中獨立于核基因組之外的遺傳物質，呈閉環(huán)雙鏈結構，具有母系遺傳、多拷貝、異質性閾值效應及變異率較高等特點。由于mtDNA 特殊的遺傳特征和環(huán)狀分子結構，mtDNA檢測分析在法醫(yī)學、群體遺傳學、人類生態(tài)學、分子進化和考古學有重要的應用意義。
mtDNA序列及異質性分析在很大程度上依賴于測序技術。Sanger測序由于流程相對繁瑣、分辨率較低、通量不足；在mtDNA異質性應用中往往受限。下一代測序技術（NGS）本質為短讀長測序，分析mtDNA需要拼接多個短片段擴增子，擴增效率對異質性比例的識別存在潛在影響。此外，短片段擴增的非特異性容易受到核線粒體DNA（nuclear mitochondrial DNA，NUMT）序列的影響，從而使mtDNA分析變得復雜。
作為最新一代基因測序技術，納米孔測序可利用其讀長長、實時測序的天然優(yōu)勢改善或避免以上限制，為異質性檢測提供全新的方法和見解。目前，納米孔測序技術的應用已在多個臨床和生物學領域得到了開發(fā)，然而，利用該技術進行mtDNA異質性檢測的研究報道卻還很少。
作為國內首家自主研發(fā)納米孔基因測序技術的齊碳科技，QNome平臺已被應用于各種生物學研究，平臺在微單倍型遺傳標記的分型研究結果已發(fā)表于Forensic Science International: Genetics (2022, 57, 102657)，其法醫(yī)適用性也得到了初步證實。（點擊此處即可跳轉閱讀原文）
此次，侯一平教授團隊基于齊碳QNome平臺，進一步開展納米孔基因測序技術在線粒體基因組研究的應用探索，以期改善傳統(tǒng)測序技術帶來的局限性，獲得更高準確性的檢測結果。
成果概述
研究團隊首先評估了四種常用的variant callers在人類mtDNA控制區(qū)異質性認證中的性能，基于模擬混合兩個合成序列( rCRS 和SSHS)樣本的QNome納米孔測序reads產(chǎn)生的不同比例（50:50, 75:25, 80:20, 85:15, 90:10, 95:5）的混合樣本。
隨后，基于QNome測序平臺自主開發(fā)了mtDNA控制區(qū)異質性檢測分析框架—CmVCall，該工具整合了多個數(shù)據(jù)處理程序，可執(zhí)行讀取過濾、去除核線粒體序列（numt）、比對、可選擇的“校正”模式和最終的異質性識別，并驗證了其在低異質性水平上的表現(xiàn)。
Fig1 CmVCall pipeline.
同卵雙胞胎（MZ）由于特殊的胚胎發(fā)生機制，具有極其相似的遺傳特征。從早期的遺傳“共識（一致性）”角度來看，他們的遺傳信息甚至是完全一樣的，無法通過常規(guī)的法庭科學DNA檢測手段來區(qū)分，也對法醫(yī)調查提出了挑戰(zhàn)。在本研究中，為了探究納米孔測序技術在雙胞胎線粒體異質性識別中的潛力，研究團隊還使用來自同卵雙胞胎（MZ）的血液、唾液和毛發(fā)樣本進行異質性檢測評估，并與NGS平臺數(shù)據(jù)進行比較。
成果亮點
1.納米孔測序結果表明CmVCall具有很高的準確性，可用于納米孔測序數(shù)據(jù)mtDNA控制區(qū)的異質性檢測。使用“無校正”選項，pipeline可以檢測到低至10%的異質性水平，而使用“校正”選項，可以準確識別5%的低頻異質性位點，精度、準確性和召回率分別為100%、99.9%和92.3%。
Fig.2Accuracy, precision, and recall of six simulation ratios with ‘No correction’
Fig.3. Accuracy, precision, and recall of six simulation ratios with ‘Correction’
Fig.3. Accuracy, precision, and recall of six simulation ratios with ‘Correction’
2. 人類線粒體基因組中多聚物（homopolymer）區(qū)域的分析一直是生物信息分析學研究中的一個挑戰(zhàn)。以往的研究在檢測異質性時，通常會丟棄這些區(qū)域。為了減少這些區(qū)域的錯誤率，測序生化體系和分析工具均在不斷改進中。本研究中，通過納米孔測序結合pipeline工具的嚴格過濾，避免了數(shù)據(jù)分析過程中不必要的“丟棄”，從而獲得更高水平的個體間和個體內多態(tài)位點。
將QNome平臺和Ion Torrent 平臺產(chǎn)生的測序數(shù)據(jù)進行對比，結果顯示，兩個平臺的異質性調用呈現(xiàn)一定程度的一致性。納米孔測序基于“校正”模式可以比NGS平臺識別出更多的異質性，并在具有高覆蓋率的多聚物區(qū)域也識別出異質性位點，顯示出納米孔測序技術的應用潛力。
3.研究團隊統(tǒng)計了每對雙胞胎三種類型樣本之間的mtDNA控制區(qū)微小差異。結果表明基于NGS數(shù)據(jù)，四對MZ雙胞胎的兩個體可以通過毛發(fā)樣本的異質性位點被區(qū)分開來，而基于QNome校正數(shù)據(jù)，雙胞胎樣本的三種樣本類型的mtDNA控制區(qū)檢測出更多的異質性，可以區(qū)分全部7對雙胞胎樣本中的兩個體。
Fig. 6. The accuracy, precision, and recall of four analytical tools (CmVCall, LoFreq, LongShot, and marginAlign) under six simulation ratios. This figure is based on QNome correction data.
結語
綜上所述，CmVCall具有很高的準確性，并且適合用于利用納米孔測序數(shù)據(jù)進行mtDNA控制區(qū)的異質性檢測。在“校正”選項下，5%水平異質性的精度、準確性和召回率分別為100%、99.9%和92.3%。在使用MZ樣本的驗證和比較中，結果表明，CmVCall可以比NGS能夠識別到更多的異質性位點，揭示了個體間和個體內mtDNA細微差別。同時，該研究還鑒定了一些具有極高覆蓋率和可信度的homopolymer異質性位點，這意味著利用納米孔測序和CmVCall檢測這些區(qū)域的異質性具有潛力。
研究團隊表示，針對homopolymer區(qū)域的額外驗證方法和新工具的不斷開發(fā)仍然是非常必要的。此次研究的調查樣本量仍然較小，預計將基于齊碳納米孔測序技術繼續(xù)使用CmVCall分析更多類型的數(shù)據(jù)集和更大的樣本量以進一步進行估計和改進，相信這一工具將為未來開發(fā)針對線粒體全基因組的納米孔測序pipeline奠定堅實基礎。
作為國內第一家全面掌握納米孔測序技術并將之推向商業(yè)化的企業(yè)，齊碳持續(xù)技術研發(fā)、擴充產(chǎn)品矩陣，不斷解鎖更多應用場景，讓這項高精尖的技術產(chǎn)生更多的現(xiàn)實生產(chǎn)力。
目前，已經(jīng)形成了以基因測序儀為核心，配套有試劑、芯片及軟件的測序平臺。此外還有實驗室自動化、生信分析等應用支撐產(chǎn)品，形成了完整的基因測序全鏈條解決方案。
今年3月，齊碳重磅發(fā)布了全新迭代升級的K2體系，帶來了更準、更穩(wěn)、更高效的測序體驗。單次準確率從90%躍升至97%，Consensus 準確率（70x）從Q40提升至Q50，不僅 Homopolymer 分辨能力大幅提升，還實現(xiàn)了高精度短序列測序，同時上樣量也大幅減少。
8月18日，齊碳時隔一年再發(fā)新品，重磅推出自主研發(fā)的中通量納米孔基因測序平臺QPursue，從低通量QNome測序平臺擴展到中通量測序平臺QPursue，不僅展現(xiàn)了齊碳強勁的研發(fā)實力和創(chuàng)新能力，也代表著國內納米孔基因測序技術的最前沿水平。
未來，齊碳科技將持續(xù)深耕，不斷提升測序性能、降低測序成本，充分挖掘納米孔測序技術的優(yōu)勢潛能，推動納米孔測序技術迭代和產(chǎn)業(yè)化應用，加速納米孔基因測序儀國產(chǎn)化時代進程！
特別鳴謝四川大學華西基礎醫(yī)學與法醫(yī)學學院的侯一平教授團隊對本文的指導！
參考文獻：
[1]Lirong Jiang, Jing Liu,Suyu Li,et,al. CmVCall: an automated and adjustable nanopore analysis pipeline for heteroplasmy detection of the control region in human mitochondrial genome.Forensic Science International: Genetics.Volume 67, November 2023, 102930.
2021年12月，齊碳科技通過5年的自主研發(fā)，成功推出國內首臺商業(yè)化的納米孔基因測序儀QNome-3841，并宣布首個生產(chǎn)基地竣工，正式開啟納米孔基因測序國產(chǎn)化時代。2022年6月，齊碳科技發(fā)布納米孔基因測序儀QNome-3841hex，標志著國產(chǎn)納米孔基因測序儀開始了矩陣化發(fā)展，這也為靈活測序場景提供全新的解決方案，將更好地滿足市場應用的多元需求。
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