你知道嗎？
BMG LABTECH讀板機(jī)的焦距設(shè)置范圍為0-25毫米（底部光學(xué)器件為0-9.7毫米）。這個(gè)距離是從微板的底部或頂部測(cè)量的，這分別取決于使用的是頂部還是底部光學(xué)器件。

用相機(jī)或手機(jī)拍照時(shí)，保持焦點(diǎn)以獲得最佳效果很重要，對(duì)吧？同樣的道理也適用于微孔板讀板機(jī)中的光學(xué)系統(tǒng)！此How To Note將重點(diǎn)介紹焦距設(shè)置，使您能夠調(diào)整微孔板讀板機(jī)的焦點(diǎn)。

在微孔板讀板機(jī)中，焦距被定義為檢測(cè)系統(tǒng)和微孔板（即樣品）之間的距離。最佳焦距指示微孔板讀板機(jī)可以檢測(cè)樣品的最高信號(hào)強(qiáng)度的平面。使用非最佳焦距進(jìn)行測(cè)量會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生負(fù)面影響。

圖1：微孔板讀板機(jī)上的焦距曲線
 

不同型號(hào)的微孔板讀板機(jī)和來(lái)自不同制造商的讀板機(jī)的功能各不相同：焦距可能不可調(diào)節(jié)，可能必須手動(dòng)輸入，也可以自動(dòng)確定。沒(méi)有焦距調(diào)節(jié)的儀器通常是靈敏度有限的入門級(jí)設(shè)備。具有手動(dòng)焦距設(shè)置的裝置需要一些試驗(yàn)和試錯(cuò)來(lái)憑經(jīng)驗(yàn)確定特定測(cè)定的最佳高度。在測(cè)量前進(jìn)行焦點(diǎn)調(diào)整的微孔板讀板機(jī)自動(dòng)識(shí)別特定樣品或一組樣品的最佳焦距（圖1）。一旦確定，您可以在體積和微孔板類型保持不變的情況下使用與之前測(cè)量相同的焦距。

你知道嗎？
從底部讀數(shù)時(shí)，焦距取決于使用的微孔板和其他因素，包括其底層的厚度。

由于液體樣品的物理性質(zhì)，信號(hào)強(qiáng)度通常在樣品的液體表面下方稍低的地方達(dá)到最高。微孔板讀板機(jī)將通過(guò)識(shí)別具有最高信號(hào)強(qiáng)度的平面來(lái)相應(yīng)地確定最佳焦距。增加焦距將使光學(xué)焦點(diǎn)在液體表面上方移動(dòng)。相反，減小焦距將使光學(xué)焦點(diǎn)向微孔板底部的方向移動(dòng)。在這兩種情況下，樣品的信號(hào)強(qiáng)度將降低，信號(hào)與空白的比率（圖2）和測(cè)定窗口將降低。

圖2：焦距設(shè)置對(duì)信噪比的影響
 

在本案例中，在不同的焦點(diǎn)高度測(cè)量100nM的熒光基團(tuán)標(biāo)準(zhǔn)樣品和空白樣品，計(jì)算并繪制了相應(yīng)的信噪比（S/B）與焦距的關(guān)系圖。自動(dòng)焦距調(diào)節(jié)產(chǎn)生了9.3mm的最佳焦距，并獲得了所有測(cè)試結(jié)果的最佳S/B值。當(dāng)偏離確定的最佳值時(shí)，S/B值顯著降低。

值得注意的是，不同應(yīng)用的最佳焦距可能不同，它取決于平板類型、加樣體積和測(cè)定類型。例如，當(dāng)測(cè)量粘附細(xì)胞樣品時(shí)，信號(hào)強(qiáng)度通常位于微板孔的底部。

次優(yōu)焦距設(shè)置不僅會(huì)影響測(cè)量樣本的信號(hào)強(qiáng)度。它也會(huì)影響數(shù)據(jù)變化（圖3）。與使用非最佳焦距時(shí)會(huì)降低的信號(hào)與空白比相比，樣品重復(fù)之間的變化（%CV）會(huì)增加，從而進(jìn)一步降低測(cè)定的讀數(shù)質(zhì)量。

焦距設(shè)置也會(huì)影響數(shù)據(jù)點(diǎn)的變化。為了強(qiáng)調(diào)這一原理，我們計(jì)算了在不同焦距下三個(gè)重復(fù)的測(cè)量的100nM熒光基團(tuán)標(biāo)準(zhǔn)樣品的%CV值。如圖3所示，在微孔板讀板機(jī)確定的最佳焦距9.3下進(jìn)行測(cè)量時(shí)，獲得了最低的%CV值。在偏離該最佳值的焦高處的測(cè)量導(dǎo)致更大的變異。雖然對(duì)于低于最佳高度的焦高，%CV的增加不明顯，但與最佳條件相比，使用高于9.3mm的高度導(dǎo)致%CV顯著增加高達(dá)3%。

圖3：焦距設(shè)置對(duì)數(shù)據(jù)變化的影響
 

你知道嗎？
通過(guò)在具有EDR功能的BMG LABTECH微孔板讀板機(jī)上開(kāi)始測(cè)量時(shí)選擇自動(dòng)對(duì)焦，讀板機(jī)可以自動(dòng)識(shí)別具有最強(qiáng)信號(hào)的樣本，并調(diào)整該孔的焦距。

你知道嗎？
BMG LABTECH的線上文檔庫(kù)包含各種各樣的應(yīng)用說(shuō)明，這些說(shuō)明突出了我們的微孔板讀板機(jī)上常用分析的性能，并為讀板機(jī)設(shè)置提供了建議，包括焦距。

如何在BMG LABTECH閱讀板機(jī)上調(diào)整焦距

在“開(kāi)始測(cè)量”窗口中選擇測(cè)試程序后，可以調(diào)整BMG LABTECH讀板機(jī)的焦距。只需選擇一個(gè)要進(jìn)行焦點(diǎn)調(diào)整的樣品孔（或多個(gè)孔），選擇“新焦距”或“自動(dòng)對(duì)焦”（如果可用），然后單擊“開(kāi)始調(diào)整”按鈕。

正如你所看到的，將微孔板讀板機(jī)設(shè)置調(diào)整到適當(dāng)?shù)慕咕鄬?duì)于獲得最佳結(jié)果至關(guān)重要。然而，這樣做的先決條件是，必須將板上樣品孔的加樣體積差異保持在最低限度。

由于最佳焦距是根據(jù)一個(gè)樣品孔的加樣體積確定的，因此孔之間的體積差異，無(wú)論是由于移液誤差無(wú)意造成的，還是由于不同體積的移液有意造成的，都會(huì)改變結(jié)果。如以下示例中所強(qiáng)調(diào)的（圖4），即使孔之間的幾微升差異也會(huì)導(dǎo)致測(cè)量信號(hào)強(qiáng)度的顯著變化。

在本案例中，將不同體積（10至30μL）的10nM熒光基團(tuán)標(biāo)準(zhǔn)品分配到微孔板的不同孔中。在具有15μL樣品體積的孔上進(jìn)行焦點(diǎn)調(diào)節(jié)。隨后用獲得的設(shè)置測(cè)量所有樣品，并將測(cè)量數(shù)據(jù)相對(duì)于來(lái)自15μL孔的測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化。如圖4所示，在加樣量較低或較高的孔上使用15μL體積的最佳焦距將導(dǎo)致顯著偏差。即使樣品體積只有2.5μL的微小差異也會(huì)導(dǎo)致信號(hào)強(qiáng)度出現(xiàn)20%的偏差。在某些情況下，這甚至可能導(dǎo)致信號(hào)的增加，這是由于在具有更高樣品體積的孔中包含的分析物的總量更高。

圖4：微孔板中不同加樣體積對(duì)熒光信號(hào)的影響
 

 

結(jié)論

焦距設(shè)置不僅對(duì)正確描述分析的所有數(shù)據(jù)點(diǎn)很重要，而且對(duì)減少數(shù)據(jù)變異也很重要。在測(cè)量前進(jìn)行焦距調(diào)整可確保微孔板讀板機(jī)正確記錄測(cè)試樣本。

 

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