無論用什么方法制備抗體,也不論制備何種抗體。制備的抗體的功能驗證是十分重要的,而功能驗證的前提是要得到高純度的蛋白。通常我們使用的驗證功能的方法是間接法elisa檢測。間接elisa的原理這里不再贅述,但我們需要確定所用酶標抗體,這通常是表達的蛋白上所帶有的標簽蛋白的抗體。在此我們以噬菌體表面展示為例,說明抗體制備的ELISA鑒定抗體選擇。
首先對表面展示相關載體做一個介紹:
pADL-10 Low-Display Phagemid Vector Series:
The phagemid pADL-20 Vector Series:
pADL-100 Maximum Display Phagemid Vector Series:
fADL Multivalent Phage Vector Series:
pHAL30:
phen:
pCANTAB:
這里只展示了一些載體的圖譜,但通過這些載體的組成,我們可以了解到:用噬菌體展示技術制備抗體時,選擇的噬菌體或嗜菌粒表面展示載體通常都帶有標簽蛋白——
His標簽:該融合標簽是由六個組氨酸殘基組成的,可于目的蛋白的C端或N端插入,是蛋白純化最常用的標簽,可以利用鎳柱將與His標簽融合表達的目的蛋白進行純化,增加蛋白的純度。
Hemagglutinin (HA)標簽:該標簽含有9個氨基酸,序列為YPYDVPDYA,其源于流感病毒紅細胞凝集素表面的抗原決定簇,對目的蛋白的空間結構影響小, 易融合表達到目的蛋白的N端或C端。易于用Anti-HA抗體進行ELISA等檢測。
Myc標簽:該標簽含有10個氨基酸,標簽序列為EQKLlSEEDL,可融合表達至目的蛋白的N端或C端。這10個氨基酸表達在不同的蛋白質(zhì)框架中仍可作為抗原表位識別其相應抗體,因此Myc tag已成功應用在 Western-blot雜交技術、免疫沉淀和流式細胞計量術中, 用于檢測目的重組蛋白的表達。
甚至有時候會帶上兩個標簽,His+HA,His+Myc,進行兩種親和層析的純化,以得到高純度、高特異性甚至高溶解性的目的蛋白。
酶標抗體可以直接用于ELISA檢測,減少了二抗的使用,可以節(jié)約時間和成本。如果利用間接ELISA方法使用酶標二抗進行檢測,在構建載體的過程中也不需要加入標簽,可以直接進行噬菌體的ELISA檢測,也不必擔心標簽的引入對抗體表達的影響。