Ross Granville Harrison成功地在體外培養(yǎng)出動物組織，并在他的文章中介紹了組織培養(yǎng)的主要原理，描述了培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞和監(jiān)測纖維發(fā)育的方法（1）。由于目前可用的條件、技術(shù)和培養(yǎng)基多種多樣，我們幾乎可以在體外培養(yǎng)和操作每一種細(xì)胞。從“經(jīng)典”細(xì)胞生物學(xué)方法到基因工程，從生產(chǎn)重組蛋白、抗體和疫苗到癌癥研究，細(xì)胞培養(yǎng)因其多種應(yīng)用而成為一種基礎(chǔ)工具。
 

當(dāng)然，這些技術(shù)的發(fā)展是與操作模型和研究其反應(yīng)所需工具的引入同步進行的。特別是在治療領(lǐng)域，分析細(xì)胞活力、毒性和死亡機制的可能性是確定潛在治療方法的關(guān)鍵因素。根據(jù)細(xì)胞類型、首選的檢測方法、特定的實驗條件和確切的目標(biāo)，可以研究不同的參數(shù)。

 

細(xì)胞活力檢測

這些測試可用于評估最合適的細(xì)胞培養(yǎng)條件或分析特定處理/程序?qū)ε囵B(yǎng)細(xì)胞健康的影響。它們可以基于反映存活細(xì)胞數(shù)量的不同因素進行評估。由于讀出的是活細(xì)胞數(shù)，一些檢測方法可用于細(xì)胞增殖分析。以下將簡要介紹用于細(xì)胞活力研究的最典型指標(biāo)。
 

代謝活性。這可能是了解細(xì)胞是否存活和狀態(tài)是否良好的最直觀參數(shù)。它可以從不同角度進行研究。
 

線粒體是真核細(xì)胞新陳代謝的核心。它們是細(xì)胞呼吸的總部，通過一系列復(fù)雜的酶促反應(yīng)最終產(chǎn)生ATP，同時將O2分子還原為H2O。線粒體活性與細(xì)胞活力密切相關(guān)，因此耗氧率（oxygen consumption rate, OCR）是新陳代謝活躍的良好指標(biāo)：不健康的細(xì)胞往往線粒體功能失調(diào)，因此耗氧率較低。最易獲得的OCR評估策略之一是使用磷光水溶性氧探針，通過改變其發(fā)射強度來響應(yīng)溶解氧濃度的變化（2）。更具體地說，一些熒光團的熒光被分子氧淬滅：氧氣濃度越低，檢測到的信號越高。在這些檢測中，通常使用一滴礦物油來密封每個樣品，以避免大氣中氧氣的反向擴散（2，3）。該系統(tǒng)的優(yōu)點是可直接提供細(xì)胞代謝率和線粒體活性的信息，并可直接用于高通量篩選分析。然而，它對培養(yǎng)條件（如溫度和細(xì)胞密度）的相對微小變化極為敏感，必須嚴(yán)格控制以獲得可重復(fù)的結(jié)果。
 

通過線粒體活性評估細(xì)胞活力的另一種方法是量化培養(yǎng)物中的ATP，因為ATP水平與活細(xì)胞數(shù)量相關(guān)。這通常通過測量ATP在熒光素酶催化下與熒光素反應(yīng)釋放的生物熒光來實現(xiàn)（圖1）。

 

圖1 熒光素酶利用ATP氧化氧熒光素中的熒光素，從而產(chǎn)生光。

 

一組經(jīng)典的細(xì)胞活力檢測方法，同樣與只在活細(xì)胞中起作用的酶有關(guān)，是基于細(xì)胞脫氫酶還原四氮唑鹽（如MTT、XTT、WST-1、WST-8）。反應(yīng)將形成彩色的甲臢產(chǎn)物，可用分光光度法定量。有色產(chǎn)物的強度與培養(yǎng)物中活細(xì)胞的數(shù)量成正比。
 

MTT四氮唑還原測定是第一個為96孔板開發(fā)的均相細(xì)胞活力測定（4），目前仍在廣泛使用。然而，該方法在讀取吸光度之前需要一個額外的步驟來溶解甲臢，而且MTT本身對細(xì)胞也有毒性。WST-8還原產(chǎn)生一種水溶性的甲臢產(chǎn)物，無需溶解步驟。此外，它比其他四氮唑鹽更靈敏（圖2），且毒性更低。檢測完成后，相同的細(xì)胞可用于其他細(xì)胞增殖檢測。

 

圖2 使用WST-8（CCK-8）和其他四氮唑鹽進行細(xì)胞增殖試驗（貼壁和懸浮細(xì)胞模型）。

 

此外，在這種情況下，試劑盒通常不僅用于評估細(xì)胞活力，還用于細(xì)胞增殖研究。例如，在最近的幾篇研究文章中，該試劑盒被用于測量接種在新生物材料上細(xì)胞的增殖情況，這在再生醫(yī)學(xué)中具有潛在的應(yīng)用價值（6，7）。
 

膜滲透性：染料包被/排斥。細(xì)胞膜（如質(zhì)膜、核膜等）在細(xì)胞生物學(xué)中起著重要作用。它們的完整性對細(xì)胞的正常功能不可或缺，是監(jiān)測細(xì)胞活力的良好標(biāo)志。
 

包合染料可在細(xì)胞內(nèi)被動擴散，一旦被某些細(xì)胞酶家族裂解，就會被 “卡住”。一個典型的例子是鈣黃綠素引入乙酰甲氧基甲酯（AM）：一旦進入細(xì)胞，酯酶就會裂解AM基團，此時親水性更強的鈣黃綠素就無法通過質(zhì)膜，從而被困在細(xì)胞內(nèi)。失去AM基團還可使鈣黃綠素與細(xì)胞內(nèi)的鈣結(jié)合，從而容易發(fā)出熒光。由于死細(xì)胞缺乏酯酶，因此只有活細(xì)胞才會發(fā)出熒光。
 

排斥染料是一種熒光分子，只有當(dāng)細(xì)胞質(zhì)膜不完整時，即當(dāng)細(xì)胞死亡時，才能進入細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)積聚。這類分子的典型例子是兩種DNA插層染料： 碘化丙啶（PI）和7-氨基放線菌素D（7-AAD）。排斥染料可與其它熒光探針結(jié)合使用，以獲得有關(guān)細(xì)胞狀態(tài)的更詳細(xì)信息，或?qū)λ劳鰴C制進行更精細(xì)的分析。
 

最后，處于早期凋亡階段的細(xì)胞保持其膜的完整性，不會被排斥染料染色。因此，這些染料可與細(xì)胞凋亡特異性標(biāo)記物（即與熒光團連接的Annexin V）結(jié)合使用，以區(qū)分活細(xì)胞（未標(biāo)記）、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。相關(guān)內(nèi)容請查閱“檢測細(xì)胞凋亡關(guān)鍵特征的七大法寶”。

 

細(xì)胞毒性檢測

細(xì)胞毒性測定代表了細(xì)胞活性的另一面，因為它們側(cè)重于檢測和量化特定條件下的細(xì)胞損傷，它們的工作原理通常與細(xì)胞膜損傷有關(guān)。
 

線粒體活動：如前所述，線粒體利用膜電位梯度產(chǎn)生的能量產(chǎn)生ATP。線粒體膜電位（MMP）的喪失與線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的打開有關(guān)，導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)中，引發(fā)其他下游事件，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。MMP崩解檢測是檢測細(xì)胞毒性事件早期階段的關(guān)鍵。Rhod123、DiOC6和JC-1等幾種親脂性熒光陽離子染料可用于這種情況。作為帶正電荷的分子，這些染料會根據(jù)膜電位在線粒體內(nèi)積聚：健康的超極化線粒體（基質(zhì)帶負(fù)電荷較多）會積聚較多的陽離子染料，而去極化線粒體（基質(zhì)有害性較�。﹦t積聚較少的染料（8）。因此，特定處理的細(xì)胞毒性效應(yīng)可通過陽離子染料相關(guān)熒光強度的降低來測量。這就是Enzo的MITO-ID® Membrane potential cytotoxicity kit（ENZ-51019-KP002，EnzoLife）工作原理，該試劑盒含有雙發(fā)射染料。MITO-ID®探針在功能線粒體中聚集成橙色熒光聚集體，在細(xì)胞質(zhì)中聚集成綠色熒光單體。當(dāng)線粒體功能日益受損時，橙色熒光會下降。該試劑盒可進行實時MMP檢測，其靈敏度優(yōu)于同類染料（如比JC-1高10倍，圖3）。
 

圖3 使用MITO-ID®染料（紅色）或JC-1（藍(lán)色）評估經(jīng)CCCP處理的HeLa細(xì)胞中的MMP。MMP隨CCCP濃度的增加而降低，如橙色熒光的降低所示。改進的染料水溶性和免洗方案最大程度地減少了變異性，從而獲得了比使用JC-1更高的Z因子（> 0.9）。
 

酶泄漏檢測：由于細(xì)胞死亡導(dǎo)致質(zhì)膜完整性喪失，通常被限制在細(xì)胞內(nèi)的酶不可逆轉(zhuǎn)地泄漏到細(xì)胞外空間。因此，檢測這些“逃逸”酶的活性是細(xì)胞毒性的一個明顯標(biāo)志。在這種情況下，檢測乳酸脫氫酶活性（LDH）是最流行的解決方案之一。LDH是一種穩(wěn)定的細(xì)胞質(zhì)酶，在所有參與糖酵解過程的細(xì)胞中均有表達。由于細(xì)胞凋亡、壞死或其他形式的細(xì)胞損傷導(dǎo)致細(xì)胞膜完整性喪失，LDH被釋放到細(xì)胞培養(yǎng)基中（10）。
 

在典型的檢測過程中，LDH催化乳酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸，將NAD+還原為NADH。后者反過來將四氮唑鹽還原成水溶性的甲臢染料，甲臢染料的量與LDH的總活性成正比，從而與受損細(xì)胞的數(shù)量成正比（10）。與CCK-8試劑盒類似，Enzo的LDH Cytotoxicity WST assay（ENZ-KIT157，EnzoLife）使用水溶性四氮唑鹽（WST）作為底物（圖4）。

 

圖4 LDH相關(guān)細(xì)胞毒性測量原理。

 

這兩種試劑盒可視為兩種互補的檢測方法，它們的組合可在給定的實驗條件下對細(xì)胞健康狀況進行全面評估（圖5）。

圖5 Cell Counting Kit-8（ALX-850-039，EnzoLife）和LDH Cytotoxicity WST Assay（ENZ-KIT157，EnzoLife）提供了補充信息。

 

說到細(xì)胞毒性檢測，藥物誘導(dǎo)毒性篩選是我們能想到的最直接的例子，盡管這只是潛在應(yīng)用之一。例如，幾個月前，韓國的一個研究小組使用LDH Cytotoxicity WST（ENZ-KIT15，EnzoLife）檢測幽門螺旋桿菌感染后THP-1細(xì)胞的細(xì)胞毒性，研究重點是查爾酮衍生物對NLRP3炎性體激活的保護作用（11）。