大腸桿菌是重組蛋白(RPs)最有效的表達(dá)宿主之一。具有表達(dá)系統(tǒng)清晰、培養(yǎng)成本低、操作簡單、生長速度快等優(yōu)勢。被廣泛應(yīng)用于生物制藥領(lǐng)域。

 

高細(xì)胞密度發(fā)酵是指在一定的培養(yǎng)體系內(nèi)，利用改變培養(yǎng)方式或培養(yǎng)條件的方法，提高菌體生物培養(yǎng)密度，進(jìn)而增加目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量。

影響因素主要有：

① 培養(yǎng)基成分

② 菌種接種量

③ 培養(yǎng)溫度

④ 發(fā)酵液pH

⑤ 溶氧

⑥ 補(bǔ)料策略

⑦ 誘導(dǎo)方式

⑧ 生長抑制物的積累

 

01  實(shí)驗(yàn)使用的設(shè)備

Bioreactor

本實(shí)驗(yàn)采用迪必爾生物的一次性生物反應(yīng)器（3L）系統(tǒng)，包含了最大體積為3L的一次性硬質(zhì)發(fā)酵罐體和T&J-Intelli-Ferm A系列控制器（圖1）。

 

圖1 T&J-Intelli-Ferm A 臺式生物反應(yīng)器

 

該系統(tǒng)符合cGMP藥品生產(chǎn)規(guī)范。具有易于安裝的特點(diǎn)，且兼容玻璃罐體配件，可快速轉(zhuǎn)移研發(fā)管線（圖2），提高工藝開發(fā)效率，讓研究者只需關(guān)注工藝開發(fā)。

 

圖2 一次性罐體結(jié)構(gòu)

 

02  實(shí)驗(yàn)過程

Process

為了驗(yàn)證該款一次性生物反應(yīng)器能否滿足高細(xì)胞密度發(fā)酵，我們用大腸桿菌（BL21）在一次性生物反應(yīng)器（3L）上進(jìn)行了兩次測試。

 

兩次測試工作體積均為1.5L，接種量為工作體積的2%，并在發(fā)酵運(yùn)行9h左右開始補(bǔ)料，24h結(jié)束培養(yǎng)，最終OD₆₀₀分別達(dá)到84、79，驗(yàn)證了一次性生物反應(yīng)器（3L）能為大腸桿菌提供適宜的生長環(huán)境，滿足大腸桿菌的高密度發(fā)酵培養(yǎng)。

 

發(fā)酵過程中的溶氧變化可以反應(yīng)菌株的生長情況。從接種開始，溶氧隨發(fā)酵進(jìn)行逐漸降低，當(dāng)溶氧低于設(shè)定值30%時(shí)觸發(fā)溶氧關(guān)聯(lián)，攪拌、通氣逐漸上升，直至溶氧值突然激增，此時(shí)發(fā)酵液內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡，開啟補(bǔ)料關(guān)聯(lián)控制。此后在理想狀態(tài)下溶氧會在設(shè)定值附近波動（圖2），若溶氧波動較大則需要調(diào)整補(bǔ)料策略，如更改補(bǔ)料速度、補(bǔ)料關(guān)聯(lián)模式。

 

圖2 兩次實(shí)驗(yàn)溫度、溶氧、pH變化曲線

 

03  實(shí)驗(yàn)結(jié)論

Conclusion

OD₆₀₀可以反應(yīng)菌種的密度。若OD₆₀₀上升變緩或開始下降，則表明菌株已進(jìn)入生長末期，可以結(jié)束批次培養(yǎng)。

 

經(jīng)過24h的發(fā)酵培養(yǎng)，第一次實(shí)驗(yàn)菌株OD₆₀₀從搖瓶2.56增加至84，第二次實(shí)驗(yàn)菌株OD₆₀₀從搖瓶1.62增加至79，均有較高的增殖（表1）。

 

表1 兩次實(shí)驗(yàn)各階段OD₆₀₀數(shù)值

 

本次實(shí)驗(yàn)使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基，未添加微量元素、生物素等。兩批菌株經(jīng)過24h的培養(yǎng)，在裝液量1.5L、接種量2%的條件下，都有較好的生長。在同等工藝條件下，迪必爾一次性生物反應(yīng)器（3L）能達(dá)到玻璃生物反應(yīng)器同等水平。

 

實(shí)驗(yàn)說明大腸桿菌在迪必爾一次性生物反應(yīng)器（圖3）能有較好的生長，實(shí)驗(yàn)中一次性生物反應(yīng)器系統(tǒng)的溫度、pH控制較為平穩(wěn)，溶氧波動較小，能為菌株提供良好的生長環(huán)境。

 

圖3 迪必爾一次性生物反應(yīng)器（3L）系統(tǒng)

 

實(shí)驗(yàn)使用的T&J-Intelli-Ferm A系列控制器，罐體從3L到15L可選，軟件界面整合了多種補(bǔ)料策略及DO級聯(lián)方式，是理想的縮小及放大應(yīng)用發(fā)酵罐，適于所有的微生物培養(yǎng)，可輕松做到高密度發(fā)酵培養(yǎng)。