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                                                              English | 中文版 | 手機版 企業(yè)登錄 | 個人登錄 | 郵件訂閱
                                                              當前位置 > 首頁 > 技術文章 > 組織活性氧(ROS)檢測試劑盒(DHE)使用說明書

                                                              組織活性氧(ROS)檢測試劑盒(DHE)使用說明書

                                                              瀏覽次數:4432 發(fā)布日期:2023-6-9  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負
                                                              組織活性氧(ROS)檢測試劑盒(DHE)使用說明書

                                                              一、產品簡介:
                                                              組織活性氧檢測試劑盒是一種利用熒光探針DHE進行組織活性氧檢測的試劑盒。本試劑盒中的DHE ROS探針為紅色熒光的活性氧探針,具有510/610nm的最大激發(fā)/發(fā)射波長。DHE ROS探針在組織中活性氧存在的條件下,被氧化生成紅色熒光物質,紅色熒光強度與組織內活性氧水平成正比,檢測 DHE 產物的熒光強度就可以知道組織內活性氧的水平。 在激發(fā)波長510nm,發(fā)射波長610nm附近,使用熒光分光光度計、熒光酶標儀、等檢測DHE產物熒光,從而測定組織內活性氧水平。活性氧(Reactive oxygen species, ROS)包括過氧化氫(H2O2,Hydrogen peroxide)、羥基自由基(•OH,Hydroxyl radical)、單線態(tài)氧(1O2,Singlet oxygen)、 一氧化氮(NO,Nitric oxide)、超氧陰離子(•O2-,Superoxide anion)、過氧化自由基(ROO•,Peroxylradical)、過氧羥自由基(HOO•,hydroperoxyl)及其下游產物過氧化物過氧亞硝基陰離子(ONOO-,Peroxynitrite anion)、ClO-和羥化物等,參與細胞生長增殖、發(fā)育分化、衰老和凋亡以及許多生理和病理過程。
                                                                
                                                              活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產生主要是氧化磷酸化的結果,在呼吸鏈中,在某些位點會有“泄露”的電子直接和氧氣或和其他電子受體反應,在酶或非酶作用下引發(fā) 一系列反應生成不同種類的活性氧:“泄露”的電子最初和氧氣反應生成超氧陰離子自由基(O2•-)。超氧陰離子遇水生成 H2O2,同時過氧化氫也可由氧氣在單 胺氧化酶(monoamine oxidase,MAO)的作用下生成,生成的過氧化氫在髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)的催化下與 Cl-反應可生成ClO-,在鐵或銅離子的催化下發(fā)生Fenton反應生成OH•,超氧陰離子遇氮氧化物反應生成ONOO-。這些生成的高氧化活性的物質統(tǒng)稱為活性氧。
                                                                
                                                              適用:新鮮組織, 一般最好使用新鮮組織樣本檢測活性氧,反映的是組織當時的活性氧狀態(tài)。凍存的組織樣本的ROS在長期凍存過程中會損失掉,有條件的話就使用新鮮樣本,不建議使用凍存的組織樣本。已經凍存的組織樣本中殘余的ROS也可以用本試劑盒檢測。
                                                               
                                                              二、產品組成:
                                                              名稱規(guī)格 100T 200T
                                                              勻漿緩沖液 A 100 ml 2*100 ml
                                                              DHE 活性氧探針 200 μl 2*200 μl
                                                              說明書 一份
                                                               
                                                              三、自備材料:
                                                              1、熒光分光光度計或熒光酶標儀(激發(fā)波長488-535nm,發(fā)射波長610nm)
                                                              離心機,移液器,冰箱,冰盒
                                                              2、PBS 緩沖液(10mM,PH7.4 )或者 HBSS
                                                              3、離心管,吸頭,一次性手套,熒光檢測專用黑色 96孔板

                                                              四、使用注意事項:
                                                              1、螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開蓋前請短暫離心,將蓋內壁上的液體收集至管底,避免開蓋時液體灑落。
                                                              2、DHE染色液為 DMSO溶液,冬季氣溫較低時在室溫時為凝固狀態(tài),極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱溶解,吸頭也需要放在培養(yǎng)箱預熱,否者容易再次凝固在吸頭內壁產生損耗。
                                                              3、使用前,先將本品取出回溫至室溫,并對其進行簡短離心使 DMSO溶液集中于管底。
                                                              4、盡量縮短探針標記后到測定所用的時間,以減少各種可能的誤差。

                                                              五、樣本處理: 
                                                              1、剛取得的新鮮組織樣本用pbs洗凈.
                                                              2、準確稱取50mg組織,加入1ml勻漿緩沖液A,用玻璃勻漿器充分勻漿。
                                                              3、在100xg,4℃離心3分鐘,棄沉淀,取上清。

                                                              六、樣本檢測:
                                                              1、在96孔板中加入200微升勻漿上清液、2微升DHE 探針,用移液器吹打,使之充分混勻。
                                                              【注意】:
                                                              ①不同樣本的活性氧差異較大,需要根據預實驗結果調整探針用量。一般加入2ul探針,染色終濃度按試劑盒中探針母液的100-2000倍稀釋,200-1000倍稀釋適合大多數樣本。最大稀釋比例可至2000倍。
                                                              ②如果熒光強度太強,超過了檢測儀器的量程,可以減少探針用量。保證所有樣本探針用量一致即可。
                                                              ③以酶標儀檢測為例。也可以用熒光分光光度計檢測,根據所使用儀器決定勻漿液體積和染色容器。
                                                              ④染色液為DMSO溶液,冬季氣溫較低時在室溫時為凝固狀態(tài),極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱溶解,吸頭也需要放在培養(yǎng)箱預熱,否者容易再次凝固在吸頭內壁產生損耗。
                                                              ⑤微量操作時,注意探針要有效加入勻漿液,避免沒有加入。
                                                              2、在37℃避光孵育15-30分鐘。
                                                              3、置于熒光酶標儀中,后于激發(fā)波長為488-535 nm、發(fā)射波長610 nm檢測熒光強度。
                                                              【注意】
                                                              ①或使用熒光光度計等其它熒光檢測設備。
                                                              ②必須使用熒光檢測專用的黑色96孔板。
                                                              ③如果熒光強度太強,超過了儀器的檢測范圍,可以將孵育后的勻漿上清液稀釋后再檢測。一般稀釋5-50倍。

                                                              七、蛋白定量:
                                                              1. 另取50微升上清勻漿液,用PBS大約稀釋30倍。
                                                              2. 取100微升進行蛋白定量。

                                                              八、結果處理:
                                                              以熒光強度(RFU)/蛋白濃度(毫克蛋白)表示組織活性氧強度。
                                                              【注意】:
                                                              ①數據與蛋白濃度的單位無關。
                                                              ②此處以蛋白濃度數據作為校正系數,對不同樣品進行均一化處理。
                                                              ③熒光強度強則活性氧(ROS)含量高。
                                                              ④可以用實驗中對照樣本的熒光強度值為基準,待測組樣本的熒光強度值占對照樣本的百分比來比較活性氧(ROS)程度差異。
                                                               
                                                              九、常見問題分析:
                                                              ①活性氧結果如何分析?
                                                              ROS是多種物質的統(tǒng)稱,不像某一單一活性氧指標,無法檢測其絕對的含量,只能通過設置參照樣本,以參照樣本的倍數來反映目標樣本相對含量變化,這個“相對”是針對參照的。分析結果是定性的,也是沒有單位的,因為它本質上是一個比值(目標/參照)。反映的是模型樣本通過具體的干預措施(如養(yǎng)分缺失、缺氧、藥物治療或遺傳基因操控等)如何影響其ROS的變化,測定其ROS是增加或者降低了。
                                                              ②熒光強度在變化?
                                                              可以觀察到熒光的逐漸增加(由于自動氧化)或減少(由于細胞中的染料損失或光漂白)。在沒有任何刺激或誘導的情況下,健康的未經處理的樣本中的熒光突發(fā)可以指示細胞死亡或一些其他氧化事件的進展。
                                                              注意檢測時平行操作即可。
                                                                
                                                              十、存儲:2-8℃保存
                                                              如果長期不用,勻漿液2-8℃保存,探針-20℃避光保存
                                                               
                                                              十一、有效期:未拆封一年,拆封請盡快使用完
                                                              來源:上海雅吉生物科技有限公司
                                                              聯(lián)系電話:021-34661275
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