大家好，這里是專注表觀組學十余年，領跑做組學科研服務的易基因。今天給大家科普一種全新的檢測DNA羥甲基化的技術：APOBEC-coupled epigenetic sequencing，簡稱【ACE-seq】。

前言
DNA序列中胞嘧啶（C）5’ 碳位結(jié)合一個甲基基團而轉(zhuǎn)變成5mC的現(xiàn)象稱為DNA基甲基化。在5mC去甲基化的過程中，其會被氧化成5hmC，這種新的修飾稱為DNA羥甲基化。

如圖

因為5hmC是5mC去甲基化的中間產(chǎn)物，所以對于多細胞來說，同一個C位點上不同細胞往往會存在5mC或5hmC不同修飾，而5mC與5hmC對基因表達的調(diào)控作用又完全不同：啟動子區(qū)的DNA甲基化對基因表達的有抑制作用，DNA羥甲基化則會促進基因的表達。因此，對5mC及5hmC的水平進行精確地定量并分別研究十分有必要。

了解易基因的小伙伴肯定知道，易基因的看家本領OX-BS技術可以輕松的開展DNA羥甲基化的相關研究，雖然神器在手，但是不少老師反應，OX-BS研究羥甲基化成本還是過高，因為畢竟要兩個文庫結(jié)合，180G的測序數(shù)據(jù)都是白花花的銀子啊。易基因的研發(fā)小伙伴牢記老師們的反饋，日以繼夜的奮戰(zhàn)終于在6月之際。推出新一代羥甲基化研究科研服務產(chǎn)品‍：APOBEC-coupled epigenetic sequencing ，簡稱(ACE-seq)。

ACE-seq是一種全新的檢測DNA羥甲基化的技術，由美國賓夕法尼亞大學Emily K Schutsky等在2018年發(fā)表在Nature Biotechnology雜志上。不同于傳統(tǒng)的BS-Seq，該技術使用AID/APOBEC家族DNA脫氨酶APOBEC3A (A3A)代替化學脫氨，保證了DNA的完整性。A3A能夠特異地脫去C及5mC的氨基使其變?yōu)閁，而5hmC則因為不被該酶識別，測序時仍被檢測為C。這樣，便將5hmC與C及5mC區(qū)分開來。

該技術原理示意圖如下：

首先，利用T4 β-葡糖基轉(zhuǎn)移酶（βGT）將5hmC轉(zhuǎn)化成5ghmC，5ghmC不會被A3A酶脫氨基；然后，利用A3A酶特異去除C和5mC的氨基，使其轉(zhuǎn)變成U，而5hmC保持為C，從而將5hmC和C/5mC區(qū)分開來。

ACE-Seq具有以下優(yōu)勢：
(1)檢測范圍為全基因組，可以得到基因組上大部分C位點的羥甲基化水平。
(2)單堿基分辨率。能夠檢測單個C堿基的羥甲基化水平，精確度高。
(3)低起始量。ACE-Seq利用脫氨酶實現(xiàn)5hmC與C及5mC的區(qū)分，反應條件溫和，不破壞基因組，大大減少基因組DNA的損失，因此起始DNA量比常規(guī)的oxBS技術降低100倍。
(4)高準確性。絕大部分甲基化修飾的C都被轉(zhuǎn)化成U，而絕大部分經(jīng)過糖基化修飾的5hmC（5ghmC）則保持為C，表明該技術具有充分的可靠性。

如下圖：

(5)經(jīng)濟性。僅需一個文庫解決問題，羥甲基化研究成本大大降低。

ACE-Seq獨有的優(yōu)勢使其在羥甲基化檢測領域擁有巨大的潛力。‍

為了讓大家全面理解掌握自己究竟該選擇哪種羥甲基化研究技術，我們再來溫習一下oxWGBS-Seq。該技術將傳統(tǒng)的BS-Seq技術與化學氧化相結(jié)合，先利用高釕酸鉀將DNA上的5hmC氧化成5fC，再用重亞硫酸鹽處理，5fC和沒有任何修飾的C就被轉(zhuǎn)化成U，而5mC則不會被轉(zhuǎn)化，仍然保持為C。

原理示意圖如下：

(1)可以同時檢測甲基化和羥甲基化的水平。
(2)檢測范圍為全基因組，可以得到基因組上大部分C位點的甲基化和羥甲基化水平。
(3)單堿基分辨率。能夠檢測單個C堿基的甲基化和羥甲基化水平，精確度高。‍

由于以上優(yōu)點，oxWGBS被稱為精準甲基化和羥甲基化檢測的“金標準”。

根據(jù)oxWGBS還可以衍生出oxRRBS技術。oxRRBS是簡化代表性重亞硫酸鹽測序（RRBS-Seq）技術與化學氧化技術的結(jié)合，可以針對基因組上CpG含量高的區(qū)域（如CGI，啟動子等重要的調(diào)控區(qū)域）進行甲基化及羥甲基化水平檢測。由于oxRRBS只針對CpG含量高的區(qū)域進行檢測，而這些區(qū)域往往是重要的調(diào)控區(qū)域，使得oxRRBS技術能夠以較低的成本檢測關鍵基因組區(qū)域的甲基化及羥甲基化水平。

然而以上兩種技術有兩個共同的缺點。

首先，由于重亞硫酸鹽處理對DNA有強烈的破壞作用，導致建庫過程中會損失大量DNA，因此該技術需要的DNA起始量較高；另外，由于該技術需要構(gòu)建兩個文庫，會導致成本的上升。

此外，還可以利用hMeDIP-Seq技術來檢測DNA羥甲基化。hMeDIP利用5hmC特異性抗體富集基因組上發(fā)生羥甲基化的DNA片段，結(jié)合高通量測序，檢測基因組上羥甲基化的區(qū)域。

原理示意圖如下：

該技術針對羥甲基化的片段進行測序和定量，成本大大降低。但該技術無法達到單堿基分辨率，也無法得到精確的羥甲基化率，只能得到羥甲基化修飾的信號強度。

參考文獻：
doi:10.1038/nbt.4204